بخشی از مقاله
چکیده:
فلفل قرمز گیاهیست که به منظور استفاده از میوه قرمز رنگ آن، با اهداف زیادی از جمله مصرف در صنایع غذایی، رنگ و پزشکی کشت می شود. به علت با ارزش بودن میوه این گیاه، شناخت ژن های شرکت کننده در مسیر مقاومت به تنشها از مهمترین مسائل این گیاه است، که با روشن شدن این مسیر می توان ابتکار عمل در نظم میوه دهی و تا حدودی زمان رسیدن محصول و عوامل محیطی موثر بر آن را در دست گرفت. برای کشف و شناخت بهتر از مکانیزم مولکولی موثر در آغاز رشد گیاه، به طور اختصاصی ژن و میزان بیان ژن AREB مورد بررسی قرار گرفت. توالی این ژن همسانی بالایی با اعضای خانواده جعبه G دارد - از عوامل رونویسی در بیان پروتئین های کنترل تنشها - دارند.
در این پژوهش، ژن AREB با استفاده از منابع بیوانفورماتیک، مورد مطالعه قرار گرفت و پرایمرها جهت تکثیر این ژن طراحی شدند. در ادامه، cDNA آن توسط آنزیم رونوشت بردار معکوس ساخته شد و به عنوان الگو برای تکثیر ژن AREB در واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفت. میزان بیان ژن AREB در ساقه و ریشه بیشترین و در برگها کمترین مقدار را نشان دادند. طی واکنش PCR قطعه ایی به طول 950 جفت باز از cDNA و قطعه ای به طول 1350 جفت باز از DNA ژنومی تکثیر یافت. این ژن، یک پروتئین 225 اسیدآمینهای را رمز میکند که دارای منطقه با توالی جعبه G میباشد. با تجزیه و تحلیل ساختار مولکولی پروتئین رونوشت شده و بر اساس مدل سازی همولوژیکی، شکل فضایی آن نشان داد، که این پروتئین ساختاری منظم دارد.
مقدمه
خشکی از جمله تنشهای فیزیکی است که به عنوان مهمترین عامل محدود کننده رشد و تولید گیاهان زراعی در اکثر نقاط جهان Blum در سال 1996 اظهار داشته که خشکی و ایران شناخته شده است. به عنوان تنش چند بعدی، گیاهان را در سطوح مختلف ساختاری تحت تاثیر قرار میدهد .تنش در طبیعت عموما به صورت انفرادی عمل نمیکند بلکه تنشهای زیادی به موازات هم روی گیاه اثر می گذارند . طبیعت در پاسخ به پیامهای حاصل از تنش، مسیرهای متنوعی در جهت غلبه و تحمل آنها گسترش داده است . این مسیرها به طور هماهنگ در جهت کاهش اثرات تنش عمل میکنند یکی از پیامدهای رایج ناشی از تنش خشکی، کاهش پتانسیل آب در بستر بذر میباشد. - 2005Mahajan and Tuteja
پتانسیل منفی بالای آب خصوصا در مراحل اولیه جوانه زنی، منجر به کاهش جذب آب توسط دانه و مانع تداوم فرایندهای مربوط به خشکی به عنوان مهم-جوانهزنی میشود. - 2003 . - Boydak et al خشکی به عنوان مهمترین فاکتور کنترل کننده عملکرد محصولات، تقریبا روی کلیه فرایندهای رشد گیاه تاثیرگذار است. یکی از تغییرات فیزیولوژیکی که به هنگام خشکی ممکن است روی دهد، تنظیم فشار اسمزی است .تنش اسمزی در واقع کمبود آب را به گیاه القا می کند - . - Umezawa et al. 2002; Horie 2012
تنظیم اسمزی به عنوان جزیی مهم از مکانیسمهای تحمل به خشکی در گیاهان مطرح است . - Pagter et al 2005 - گیاهان در شرایط متفاوت محیطی، مواد محلول سازگار از قبیل اسیدهای آمینه، قندها و یونها را سنتز میکنند .تجمع این مواد سبب کاهش پتانسیل آب اندامهای گیاهی شده و جذب آب توسط گیاه را امکانپذیر می سازد . - Pagter et al.2005 - در بسیاری از گیاهان حفظ تورژسانس توسط تنظیم اسمزی موجب بهبود عملکرد و زندهمانی آنها در شرایط تنش خشکی میشود .گیاهان از طریق تغییر در فرایندهای موفولوژیکی، فیزیولوژیک و متابولیسمی به تنش خشکی پاسخ میدهند .غلظت هورمون آبسیزیک اسید در اندامهای گیاهی در پاسخ به تنش خشکی افزایش می یابد و نقش اصلی را در سازگاری به تنشهای محیطی ایفا میکند ژنهای گوناگونی در پاسخ به فقدان آب در بسیاری از گونههای گیاهی گزارش شده است. . - Bray 1997; Campalans et al. 1999. -
به طور کلی می توان ژن ها و پروتئین هایی را که در مقاومت به خشکی در گیاهان دخیل هستند را به 4 دسته تقسیم نمود: Osmotic ally active compounds، Functional proteins، Transcription factors، .Signaling factors ژن های متعددی شناسایی شده که پروتئین های فانکشنال را کد کرده و این پروتئین ها نقش مهمی در مقابله با تنش خشکی را دارند، اخیرا نیز برخی از این ژن ها بوسیله مهندسی ژنتیک به بسیاری از گیاهان زراعی انتقال یافته و نتایج مثبتی در این خصوص حاصل شده است. که از مهمترین آنها ژن AREB می باشد. عوامل موجود در ناحیه پیشبر ژنهایی که در پاسخ به تنشها موثرند، برهمکنش نشان داده و منجر به cis رونویسی با توالی تنظیمی تنظیم بیان آنها میشوند - 4 - .
پیشبر در نواحی بالادست ژنها، نقش کلیدی در تنظیم بیان ژن در مراحل مختلف رشدی و متصل cis پاسخ به محیط دارند که این اعمال توسط عوامل رونویسی که به مکانهای اتصال این عوامل یا همان توالی تنظیمی میشوند، تنظیم میشود .این موتیفهای تنظیمی سبب اختصاصی شدن زمان و مکان بیان ژن میشوند و برای الگوهای بیانی خاص همچون پاسخ به تنشها در گیاهان ضروری میباشند .بررسیهای ملکولی دو مسیر تنظیمی وابسته به اسید آبسیزیک و مستقل از اسید آبسیزیک را در شبکه تنظیمی رونویسی نشان میدهد .از جمله عوامل رونویسی پاسخ دهنده به تنش خشکی ، MYB/MYC، NAC، AREB/ABF، CBF، DREB می باشند.
افزایش مقاومت در گیاه مقاوم به دلیل حضور عوامل رونویسی ژن AREB و در نهایت به دلیل کاهش فعالیت سیگنالینگها میباشد. با توجه به نقش فاکتورهای رونویسی AREB در تنظیم بیان ژنهای القا شده توسط آبسیزیک اسید و تعدادی از ژنهای درگیر در تنش خشکی، احتمالاً افزایش بیان این سیگنالینگها در رقم مقاوم، در مقاومت این رقم، تحت شرایط تنش نقش دارد.
از نقشهای عمدهی فاکتورهای رونویسی جهت سنتز پروتئینها مقاوم به تنشهای خشکی، بیان و فعال کردن، ژنهای هدف مانند ژنهای لازم برای سنتز مولکولهای حفاظتی میباشد. بهطور معمول، برای بررسی نحوه بیان ژنهای القا شونده توسط تنش خشکی ناحیه پروموتر اهمیت زیادی دارد.
بیان ژن AREB کد کننده یک نوع پروتئین با نام LEAREB و تنظیم این ژن مرتبط با یکسری ژنهای تنظیمی دیگر بوده که بدین ترتیب نقش مهمی را در هنگام تنش خشکی بازی میکند؛ و دسته دیگر، از پروتئینهای مؤثر مورد مطالعه در این پژوهش، پروتئین کیناز میباشند. پروتئینهای کیناز آنزیمهایی هستند که کنترل کننده فرآیندهای مختلف سلولی از جمله پاسخ به محرکهای محیطی بوده. مطالعات بسیاری به جهت شناسایی نقش پروتئین کیناز در مقاومت به تنش خشکی صورت پذیرفته. به دلیل هدفمند کردن تحقیقات آزمایشگاهی، در این مطالعه میزان بیان ژنهای AREB همچنین با کمک ابزارهای بیوانفورماتیکی، توالی و ساختار پروتئینی آنها بررسی شده است. به علاوه با هدف مطالعه کارآیی پروتئینهای فوق، ابتدا با روش تشابه، ساختار آن مدلسازی شد و در ادامه، تأثیر متیفها و اسیدآمینههایی که منجر به افزایش کارآمدی این پروتئین میشوند، پیشبینی شد. دستاوردهای پژوهش حاضر احتمالاً میتواند بهمنظور دستورزی ژن این پروتئین و در راستای ارتقا کارآمدی آن، بسیار مفید خواهد بود.
