بخشی از مقاله
چکیده
هدف: این تحقیق با هدف بررسی شدت و فراوانی آلودگی قارچی و همچنین قارچهای مولد تولید آفلاتوکسین B1 و اکراتوکسین A در ادویه فلفل قرمز ایرانی به منظور برجسته کردن ارزیابی خطر ناشی از آنها می باشد.
مواد و روشها: 36 نمونه فلفل قرمز تند سبزوار خشک شده با آفتاب و در هوای آزاد، به طور تصادفی در طی دوره برداشت، جمع آوری گردید.از محیط کشت های DG18 و YGC جهت انجام کشت عمومی و اختصاصی کپک ها به منظور شمارش کلی کپک های موجود در نمونه ها و شناسایی میکروسکوپی آنها استفاده گردید. شناسایی انواع مختلف کپک ها از همدیگر و تعیین هویت آنها با توجه به خصوصیات ماکروسکوپی کلنی های قارچی و با توجه به وجود ساختارهای اختصاصی در هریک از قارچ ها بر اساس کلیدهای شناسایی و الگوی تشریح شده توسط سامسون و همکاران - 2000 - ، انجام شد . تشخیص توانایی تولید آفلاتوکسین B1 و اکراتوکسین A توسط جنسهای قارچی موجود در نمونه ها با استفاده از روش کروماتوگرافی لایه نازک - TLC - و دستگاه UV دتکتور در طول موج 365 نانومتر صورت گرفت.
نتایج و بحث: 91 در صد از نمونه های فلفل قرمز آلوده به جنس آسپرژیلوس، 58 درصد آلوده به جنس پنی سیلیوم، 33 درصد آلوده به جنس رایزوپوس و 33 درصد آلوده به جنس آلترناریا بودند. 4 جنس کپکی و 5 گونه کپکی در نمونه ها شناسایی شد. اغلب جنس های کپکی متعلق به جنس آسپرژیلوس %42/3 - از کل سوشهای ایزوله شده - بود. سایر جنس های کپکی به ترتیب در گروه پنی سیلیوم - %27 - ، رایزوپوس - %15/4 - و آلترناریا - %15/4 - قرار داشتند. در جنس آسپرژیلوس دو گونه فلاووس و توبینجنسیس شناسایی گردید که به ترتیب 45 و 54/7 درصد از سوشهای آسپرژیلوس شناسایی شده را به خود اختصاص داد و در بین 36 نمونه فلفل قرمز، آسپرژیلوس فلاووس در 42 درصد از نمونه ها و آسپرژیلوس توبینجنسیس در 50 درصد از نمونه ها شناسایی شد . در بین سوش های ایزوله شده، %80 سوش های آسپرژیلوس فلاووس قادر به تولید آفلاتوکسین B1 و %5 سوش های آسپرژیلوس توبنجنسیس قادر به تولید اکراتوکسین A بودند. سایر جنس ها شامل پنی سیلیوم، آلترناریا و رایزوپوس توانایی تولید آفلاتوکسین B1 یا اکراتوکسین A را نداشتند.
-1 مقدمه
قارچ ها آلاینده های غالب موجود در ادویه ها هستند. خاک و هوا، منشاء اصلی ایجاد آلودگی قارچی در ادویه های خام بر روی زمین می باشند. سایر عملیات مانند برداشت، جابجایی و بسته بندی، باعث افزایش آلودگی در آنها می گردد. علاوه بر این، ادویه ها در مناطق گرمسیری با روش های ساده جمع آوری شده و به طور معمول، قبل از اینکه به اندازه کافی برای جلوگیری از رشد میکروبی خشک گردند، در معرض آلاینده های بسیاری قرار می گیرند - نیفل و برگر، . - 1994 شایعترین آلودگی قارچی موجود در ادویه ها شامل جنسهای آسپرژیلوس و پنی سیلیوم است
برخی از گونه هایی که متعلق به این جنس ها هستند، به عنوان تولید کنندگان بالقوه ترکیبات مختلف سمی مانند آفلاتوکسین ها، اکراتوکسین ها و استریگماتوکسین ها شناخته شده اند. این مایکوتوکسینها، اثرات موتاژن، تراتوژن و سرطان زا در انسان و حیوانات بجا می گذارند
واتاناب و همکاران - 1996 - نشان داده اند که میوه فلفل سیاه با وجودی که حاوی ترکیبات ضد قارچ و ضد حشره می باشد، می تواند به طیف گسترده ای از قارچ ها در سطح مزرعه آلوده گردد. اتهار و همکاران - 1988 - گزارش دادند که آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر، آسپرژیلوس نیدولنس، آسپرژیلوس اکراسئوس، گونه های پنی سیلیوم و رایزوپوس، گونه های غالب شناسایی شده از خانواده فلفل و سایر ادویه ها می باشد.
در سایر مطالعات نیز - هیتوکوتو و همکاران، 1978 و آیرس و همکاران، - 1980 گونه های پنی سیلیوم بطور شایع در بابونه و نعناع گزارش شد. در عراق، در مطالعه دیگری که توسط عبداالله و همکاران - b2002 - بر روی آلودگی قارچی موجود در گیاهان دارویی صورت گرفت، ، 24 گونه کپکی در رازیانه، 20 گونه در انیس و 14 گونه در زیره مشاهده گردید.گزارش شده است که بسیاری از آلودگی های قارچی شناسایی شده در نمونه های گیاه دارویی خشک، توانایی تولید مایکوتوکسینها را دارند
الشافی و همکاران - 2002 - عنوان کردند که %45 از گونه های آسپرژیلوس فلاووس ایزوله شده از پاپریکا قادر به تولید آفلاتوکسین بودند.
این تحقیق با هدف بررسی شدت و فراوانی آلودگی قارچی و همچنین قارچهای مولد تولید آفلاتوکسین B1 و اکراتوکسین A در ادویه فلفل قرمز ایرانی به منظور ارزیابی خطر ناشی از مصرف آنها می باشد.
-2 مواد و روش ها
-1-2 نمونه گیری
در این قسمت، از پلیت های نمونه های فلفل قرمز خشک - در فصل اول - کشت شده در محیط کشت های DG18 و YGC که به منظور شمارش کلی کپک های موجود در نمونه ها صورت گرفته بود، استفاده گردید
شکل :1 نمونه هایی از کلنی های کپک ایزوله شده از فلفل قرمز بر روی محیط کشت
-2-2 تهیه جدایه کپک ها
از محیط کشت های DG18 و YGC جهت انجام کشت اختصاصی کپک ها استفاده گردید. بدین صورت که مجددا از کلیه انواع کلنی های کپکی رشد یافته در پلیت های کشت عمومی، در محیط کشت های DG18 و YGC بر اساس روش سوزنی، کشت اختصاصی نقطه ای به عمل آمد. پس از آن پلیت ها جهت رشد کلنی ها در دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 5-7 روز گرمخانه گذاری شدند.
-3-2 شناسایی جنس و گونه کپک ها بر پایه مشاهدات ماکروسکوپی و میکروسکوپی
تشخیص انواع مختلف کپک ها از همدیگر و تعیین هویت آنها با توجه به خصوصیات ماکروسکوپی کلنی های قارچی مانند رنگ سطح و پشت کلنی ها، منظره سطح کلنی ها از حیث داشتن چین و شکن، خطوط شعاعی و یا دوایر متحدالمرکز، صاف و یا چین دار بودن سطح کلنی ها و هم چنین حالت سطح کلنی ها مانند داشتن حالت پودری، پرزی، پنبه ای، پشمی، مخملی و ... همراه با تهیه لام مرطوب با KOH ده درصد از کلنی ها و بررسی میکروسکوپی لام تهیه شده در زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100، با توجه به وجود ساختارهای اختصاصی در هریک از قارچ ها بر اساس کلیدهای شناسایی و الگوی تشریح شده توسط سامسون و همکاران - 2000 - امکان پذیر شد.
-4-2 تعیین توانایی تولید آفلاتوکسین B1 و اکراتوکسین A توسط جنس های قارچی شناسایی شده با استفاده از روش TLC پس از پایان دوره گرمخانه گذاری در مرحله کشت اختصاصی کپک ها، از محیط کشت حاصل از این مرحله، برای جداسازی و شناسایی توانایی تولید آفلاتوکسین B1 و اکراتوکسین A توسط جنسهای قارچی رشد یافته استفاده شد. در این مرحله، جهت تشخیص حضور این مایکوتوکسینها در پلیت های حاوی هر کلنی کپکی، روش خالص سازی و استخراج مایع-مایع با کمک روش کروماتوگرافی لایه نازک - TLC - و طول موج نور UV در طول موج 365 نانومتر به کار گرفته شده است. بر اساس خاصیت فلورسانس و مطابقت رنگ ایجاد شده و فاصله طی شده توسط نمونه مورد آزمون با شرایط حاصل از تزریق استاندارد این سموم، مایکوتوکسین های تشکیل شده شناسایی و تایید شدند.
-3 نتایج و بحث
از 36 نمونه فلفل قرمز خشک آلوده به کپک، بیشترین آلودگی به ترتیب مربوط به آسپرژیلوس فلاووس - 15 نمونه - ، آسپرژیلوس نایجر 18 - نمونه - ، پنی سیلیوم 21 - نمونه - ، آلترناریا - 12 نمونه - و رایزوپوس 12 - نمونه - بودند که البته در تعدادی از نمونه ها بیش از یک نوع آلودگی و کلنی کپکی وجود داشت. این نتایج نشان می دهد که 91 در صد از نمونه های فلفل قرمز آلوده به جنس آسپرژیلوس، 58 درصد آلوده به جنس پنی سیلیوم، 33 درصد آلوده به جنس رایزوپوس و 33 درصد آلوده به جنس آلترناریا بودند.
نتایج آزمون شناسایی فلور کپکی موجود در نمونه های فلفل در جدول 1 ، نمایش داده شده است. 4 جنس کپکی و 5 گونه کپکی در نمونه ها شناسایی شد. اغلب جنس های کپکی متعلق به جنس آسپرژیلوس %42/3 - از کل سوشهای ایزوله شده - بود. کلنی های این گروه %44/7 از تعداد کل کلنی های کپکی شناسایی شده بر روی نمونه ها را تشکیل می دهد. سایر جنس های کپکی به ترتیب در گروه پنی سیلیوم - %27 - ، رایزوپوس - %15/4 - و آلترناریا - - %15/4 قرار داشتند. در جنس آسپرژیلوس دو گونه فلاووس و نایجر شناسایی گردید که به ترتیب 45 و 54/7 درصد از سوشهای آسپرژیلوس شناسایی شده را به خود اختصاص داد و در بین 36 نمونه فلفل قرمز، آسپرژیلوس فلاووس در 42 درصد از نمونه ها و آسپرژیلوس نایجر در 50 درصد از نمونه ها شناسایی شد.
جدول :1 تعداد و درصد سوشهای ایزوله شده از نمونه فلفل قرمز سبزوار
