بخشی از مقاله
چکیده
استافیلوکوکوس ارئوس با انواع مختلف آنتروتوکسین هایی که تولید می کند یکی از عوامل شایع ایجاد مسمومیت غذایی با علائم دل درد و استفراغ می باشد. هدف از این تحقیق شناسایی استافیلوکوکوس ارئوس های مولد انتروتوکسین در شیر فله با استفاده از روش PCR بود. نمونه های شیر از مغازه های توزیع شیر فله در سطح شهر کرمان اخذ گردید. ابتدا DNA باکتری به صورت مستقیم از نمونه های شیر استخراج و سپس با روش PCR نمونه ها از نظر انتروتوکسین های sea, seb, sec و sed بررسی شدند. از 100 نمونه شیر 5 نمونه ژن مربوط به انتروتوکسین a و 2 نمونه ژن مربوط به انتروتوکسین b را داشتند.
ژن مربوط به آنتروتوکسین c و d در هیچکدام از نمونه ها شناسایی نشد. روش های مختلفی جهت شناسایی قابلیت تولید توکسین وجود دارد که می توان به آگلوتیناسیون و الایزا اشاره نمود. این روش ها اغلب قادر به شناسایی غلظت کم توکسین نمی باشند بنابراین شناسایی مستقیم ژن کد کننده انتروتوکسین ها با استفاده از روش PCR معیار مناسبی جهت مشخص نمودن قابلیت تولید توکسین توسط باکتری است و از دقت عمل بالاتری برخوردار می باشد.
مقدمه
استافیلوکوک ها سلول های کروی گرم مثبت هستند که معمولا در شکل دسته جات نامنظمی شبیه به خوشه های انگور آرایش می یابند - . - 1 استافیلوکوکوس ارئوس18 علاوه بر بیماری زایی برای انسان در فساد مواد غذایی نیز نقش دارد و یکی از چهار عامل شایع و مهم در ایجاد مسمومیت غذایی می باشد - . - 2 بعضی از آن ها فلور طبیعی پوست و غشاء های مخاطی انسان بوده و بقیه آن ها عامل بروز عفونت های چرکی، تشکیل آبسه و حتی سپتی سمی کشنده19 هستند.
این طور تخمین زده میشود که 20 درصد از مردم به مدت طولانی، ناقل باکتری باشند . - 9 - انواع مختلفی از انتروتوکسین20 توسط استافیلوکوکوس ارئوس تولید شده است. که - sea-seu - از جمله انتروتوکسین های استافیلوکوکوس ارئوس بوده است
حداقل 6 توکسین محلول - A-F - توسط قریب به 50% از سوش های استافیلوکوکوس ارئوس تولید می شوند. انتروتوکسین ها مقاوم در برابر حرارت هستند. آن ها به مدت 30 دقیقه در دمای جوش آب، مقاومت نموده و در برابر آنزیم های روده، پایدار می باشند. و به آنزیم های پروتئولیتیک معده مانند پپسین و تریپسین نیز مقاوم هستند و قابل حل در آب و محلول های نمکی هستند مقاوم به انجماد و خشک کردن می باشند
بیش از %95 مسمومیت غذایی استافیلوکوکی21 به دلیل انتروتوکسین های کلاسیک sea تا see بوده است و تنها %5 باقی مانده به علت انتروتوکسین های تازه کشف شده بوده است در چند دهه گذشته sfp عامل سوم بیماری های ناشی از غذا بوده است با وجود اینکه بیماری به صورت خود محدود شونده و با تعداد مرگ کم می باشد ولی با این حال یکی از مهم ترین عوامل اقتصادی در سراسر جهان شناخته شده است
مسمومیت با استافیلوکوکوس ارئوس باعث ایجاد تهوع، استفراغ، کرامپ های شکمی و اسهال ظاهر شده است - . - 13 غذاهای مختلفی می توانند توسط انتروتوکسین ها آلوده شوند. غذاهایی که حاوی نشاسته و پروتئین هستند مانند گوشت و فراورده های گوشتی، مرغ، تخم مرغ، شیر و محصولات لبنی.
PCR نیز به روش ازدیاد مقادیر جزئی DNA یا RNA است که موجب شناسایی سریع و اختصاصی نوع سلول یا میکروارگانیسم مورد نظر و آنتروتوکسین آن می شود. این روش شامل چندین مرحله با استفاده از تغییر حرارت می باشد: -1 مرحله دناتوراسیون -2 DNA مرحله پرایمر و اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی -3 مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز و بعد از این سه مرحله چرخه اول تکرار می شود و چرخه های بعدی تکرار سه چرخه ی بالا است
روش کار نمونه گیری
این مطالعه در شهر کرمان اجرا شد. تعداد 100 نمونه شیر خام گاو از سطح مغازه های عرضه کننده ی شیر و فرآورده های آن در سطح شهر کرمان جمع آوری شد. تمامی نمونه ها شماره گذاری و بر روی فرم جمع آوری داده ها و نیز بر روی نمونه شماره نمونه ثبت گردید. نمونه ها در مجاورت یخ به آزمایشگاه بهداشت مواد غذایی دانشکده دامپزشکی ارسال و مورد آزمایش قرارگرفت.
استخراج DNA از نمونه های شیر
استخراج DNA با استفاده از کیت ساخت شرکت سیناکلون Sinapure, Cat No EX 6021 و مطابق دستورالعمل آن انجام شد.
آماده سازی پرایمرها
در این روش 8 جفت پرایمر جهت تکثیر هر کدام از ژن های انتروتوکسین موجود از شرکت سیناکلون - تهران- ایران - تهیه شدند. پرایمرها به صورت لیوفیلیزه بوده و قبل از شروع کار پرایمر ها را با آب مقطر لازم که مقدارشان در پروتکل آمده بود رقیق شدند.
جدول :1 پرایمرهای مورد استفاده
ارزیابی مولکولی سوش های جدا شده برای تشخیص حضور سم در نمونه ها با روش PCR انجام شد. برای هر یک از ژن های کد کننده انتروتوکسین به صورت جداگانه با استفاده از کیت ساخت شرکت سیناکلون - - Sinaclon,Tehran, Iran در حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 5 میکرولیتر DNA استخراج شده از هر نمونه ، 12/5 میکرولیتر مستر میکس با غلظت 2X، 6 میکرولیتر پرایمر و 1/5 میکرولیتر آب مقطر استریل انجام گرفت. نمونه ها داخل دستگاه ترمال سایکلر - - BioRad, USA به مدت 2 ساعت قرار داده شد. برنامه PCR شامل یک مرحله به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد و 35 مرحله تکرار شونده که هر مرحله 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 50 درجه سانتی گراد به مدت 40 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و مرحله آخر 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد بود.
الکتروفورز
محصول حاصل از چرخه ی PCR به ژل الکتروفورز منتقل و باند ها توسط دستگاه ژل داک مشخص و ثبت شد. به این منظور ژل %1/3 تهیه و باند ها توسط دستگاه ژل داک در مانیتور مشاهده و ثبت شد - دستگاه TV Zoom Lenz ساخت کشور ژاپن - .
نتایج
در این تحقیق 100 نمونه شیر مورد آزمایش قرار گرفتند. ژن های کد کننده انتروتوکسین های مربوط به sea در 5 نمونه شیر و seb در دو نمونه شیر یافت شدند.
