بخشی از مقاله
چکیده
روش هاي مولکولی مبتنی بر RT-PCR علیرغم داشتن برخی معایب اجتناب ناپذیر ولی قابل رفع، به دلیل حساسیت بالا در ردیابی عوامل بیماري زاي گیاهی بویژه ویروس ها و ویروئیدها کماکان به عنوان یکی از پرطرفدارترین روش ها در برنامه هاي گواهی نهال مورد استفاده قرار می گیرند. هزینه نسبتا بالاي این روش ها، تعداد زیاد نمونه ها در واحد زمان، زمان محدود براي گواهی از نظر آلودگی به چندین عامل بیماري و لزوم کنترل همزمان درستی آزمون، باعث شده تا روش هاي مبتنی بر RT-PCR چندگانه براي رفع این موانع توسعه داده شوند. در این مطالعه، این روش ها براي عوامل بیماري زاي مهم مرکبات - ویروس هاي عامل بیماري هاي تریستزا و کاچکسیا - و زیتون - ویروس هاي موزائیک خیار، موزائیک اربیس و پیچیدگی برگ گیلاس - همراه با تکثیر ژن کنترل داخلی براي برنامه هاي گواهی نهال مرکبات و زیتون بهینه سازي شد.
مقدمه
در میان روش هاي مختلف ردیابی آلودگی هاي ویروسی و ویروئیدي در مواد تکثیري درختان باغی - سرولوژیک، بیولوژیک و مولکولی مبتنی بر اسید نوکلئیک - ، روش مولکولی مبتنی برRNA به دلایل زیادي از جمله بالا بودن دقت، سرعت، حساسیت، تکرار پذیري و امکان کنترل مراحل چندگانه واکنش ها همواره به عنوان روش هاي متداول در برنامه هاي کنترل و گواهی نهال مورد استفاده قرار گرفته اند . - Bernard & Duran-Vila, 2006; Faggioli et al., 2005; Garnsey et al., 2002 - .
هر چند که روش هاي سرولوژیک و بویژه بیولوژیک در ترکیب با این روش ها، آزمون هایی مهم و مناسب براي ردیابی آلودگی ها در تعداد محدود نمونه ها در طبقات بالاي نهال - هسته هاي اولیه، پیش تکثیر و باغات مادري - محسوب می شوند، ولی تعداد زیاد و غیر قابل مقایسه نمونه ها در نهالستانها در سطح یک کشور، باعث شده تا براي گواهی نهال بویژه روش هاي بیولوژیک به دلیل طولانی مدت بودن زمان آزمونها - ماهها تا چندین سال - چندان قابل استفاده نبوده - Calavan, 1968; Malfitano et al., 2005; Albanese et al., 2012 - و نیاز به روش هاي سریعتر مانند روش هاي مولکولی مبتنی بر اسید نوکلئیک بیشتر شود.
با توجه به استانداردهاي ملی/منطقه اي و بین المللی ممکن است ردیابی تعداد زیادي عامل بیماري در نمونه - ها - وجود داشته باشد. از طرف دیگر، هزینه نسبتا بالاي این روش ها با عث می شود تا اقشار خاصی از جامعهکشاورزي با درآمدهاي بالا توان پرداخت هزینه ها را داشته باشند. جلوگیري از نتایج دروغین مثبت/منفی و نیز کنترل مراحل مختلف واکنش ها بویژه واکنش هاي مبتنی برRNA نیز مزید بر علت می باشد.
امروزه آزمون هاي مبتنی بر واکنش زنجیره اي چندگانه براي برآوردن نیاز هاي فوق الذکر به فراوانی در برنامه هاي کنترل و گواهی نهال مورد استفاده قرار می گیرند 2006; Grieco et al., 2000; Menzel et al., 2002, Sanchez_Navarro et al., 2005; Bernard & Duran-Vila, 2006; .Grieco et al., 2000 - این نوع واکنش هاي چندگانه امکان ردیابی چندین عامل بیماري را در یک واکنش فراهم نموده و بنابراین به تعداد عوامل بهینه سازي شده در یک واکنش، هزینه ها نیز با همان تصاعد کاهش پیدا میکنند.
بعلاوه، بهینه سازي تکثیرقطعه اي از ژنوم میزبان به عنوان کنترل داخلی به همراه عوامل بیماري زا، امکان کنترل مراحل مختلف واکنش را در هنگام تکثیرقطعات ژنومی عوامل بیماري زا فرا هم می آورد - Menzel et al., 2002; Sanchez -Navarro et al., 2005; Naderpour et al.,.2013, 2014, 2015a, b - به دلایل اشاره شده، براي بررسی همزمان عوامل ویروسی مندرج در استانداردهاي ملی سلامت زیتونArabis mosaic Nepo virus - ArMV - , Cherry leafroll Nepovirus - CLRV - , Cucumber mosaic Cucumovirus - CMV - و دو بیماري ویروسی و ویروئیدي فوق العاده مهم در گواهی مرکبات Citrus tristeza Closterovirus - CTV - - و Hop stunt - viroid - HSVd - در تحقیق حاضر بهینه سازي شد.
مواد و روشها
نمونه هاي آلوده به ویروس هاي CTV، ArMV، CMV و CLRV از باغات آلوده مرکبات، زیتون، دانه داران و هسته داران نواحی مختلف کشور جمع آوري گردید. آلودگی نمونه ها به ویروس هاي مورد نظر با استفاده از آزمون سرولوژیکی الایزا و آنتی بادي هاي تهیه شده از شرکت هاي Agdia وBioreba ،آمریکا و سوئیس - به ترتیب - بر اساس پروتکل هاي توصیه شده بررسی شد. استخراج RNA ژنومی کل نمونه ها با استفاده از کیت استخراج - Gene All, South Korea - RNA انجام شد.
تهیه CDNA ویروس ها با استفاده از آنزیم M-MuLV - Sina gene, Iran - و آغازگر هگزامر تصادفی در دماي 42 °C و در ویروئید HSVd بااستفاده از آغازگر اختصاصی معکوس - Bernard & DuranVila, 2006 - و آنزیم Reverse Transcriptase H_ - ThermoScientific, USA - در دماي 55°C انجام و واکنش هاي زنجیره اي پلیمراز - PCR - یک گانه، دو گانه و چند گانه براي ویروس ها و ویروئید فوق و نیز ژن کنترل داخلی - Nad5 - با استفاده از آغازگر هاي توصیه شده در منابع علمی یا طراحی شده توسط نگارندگان - Naderpour et al., 2013, 2014, 2015a, b - انجام شد.
محصولات PCR با استفاده از ژل آگارز %1/5 الکتروفورز شده و در زیر نور UV بررسی شد. به منظور بررسی بیشتر صحت واکنشهاي RT-PCR، قطعات ژنومی تکثیر شده پس از جداسازي از ژل و خالص سازي با استفاده از کیت مربوط شرکت Vivantis - South Korea - به طور مستقیم یا پس از همسانه سازي در ناقلPTZ9 - Sina Gene , Iran - ، در شرکت Macrogene - South Korea - توالی یابی شدند.
نتایج و بحث
آزمون هاي سرولوژیکی مبتنی بر الایزا با آنتی بادي هاي اختصاصی ویروس هاي CTV، ArMV، CMV و CLRV ، آلودگی نمونه ها را به ویروس هاي مذکور تایید نمود. با توجه به چالش هاي موجود در ردیابی ویروس هاي داراي ژنوم RNA و نیز ویروئیدها، لزوم کنترل مراحل مختلف واکنش هاي RT-PCR - استخراج RNA، تهیه cDNA و واکنش نهایی - PCR با تکثیر cDNA مربوط به RNA حداقل یکی از ژن هاي اندمیک گیاه ضروري می باشد - Menzel et al., 2002 ; Sanchez-Navarro et .al., 2005; Naderpour et al., 2013, 2014, 2015a, b - این مهم بویژه در RNA استخراج شده از برخی از گیاهان از جمله دانه داران، هسته داران و مرکبات به دلیل حضور بالاي پلی ساکاریدها و پلی فنولیک ها و در همه گیاهان به دلیل حضور ریبونوکلئازهاي اندمیک بسیار ضروري است .
- Gibb and Padovan, 1994; Singh et al., 2002 - در تحقیق حاضر ابتدا تکثیر موفق قطعات ژنومی مربوط به ژن هاي پوشش پروتئینی ویروس هاي ArMV - 427 bp - ، CTV - 504 bp - و CLRV - 331 bp - ، ژن 2a ویروس CMV - 513 bp - و کل ژنوم ویروئید HSVd - 174 bp - با آغازگر هاي مربوط انجام شد - شکل هاي1 الف و ب - . ترادف ژنومی قطعات مذکور تعلق آنها را به نواحی ژنومی مرتبط از ویروس هاي فوق الذکر به اثبات رسانده و همخوانی یافته ها را با ترادف هاي ژنومی مورد استفاده در طراحی آغازگرها - ArMV, CLRV - و نیز با نتایج محققین دیگر - Bernard & Duran-Vila, 2006, Grieco et al., 2000 ; Menzel et al., 2002 ; Sanchez -Navarro et al., 2005 - به اثبات رساند.
