بخشی از مقاله
چکیده:
به منظور شناسایی کنه هاي ناقل بابزیا اویس در گوسفندان شهرستان مشهد، مطا لعه اي با استفاده از روش واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - انجام گرفت. طی فصول بهار وتابستان 1358 نسبت به جمع آوري کنه، از روي گوسفندان مشکوك به آلودگی بابزیا اقدام گردید. ابتدا کنه ها بااستفاده از کلید تشخیص مورد شناسایی قرار گرفتند. آنگاه نسبت به استخراج DNA نمونه هاي کنه اي اقدام شد. تکنیک PCR براي تعیین بابزیا اویس بااستفاده ازدو پرایمر اختصاصی طراحی شده انجام گرفت.
نتایج یکی از پرایمر ها،روي نمونه هاي کنترل مثبت خون رضایت بخش بود. نتایج PCR با استفاده از این پرایمر ، وجود باند اختصاصی 550 bp را روي ژل آگار ، در 2 نمونه از 20 نمونه DNA رپی سفالوس سینگوینوس ، 7 نمونه از 13 نمونهDNA هیالوما مارژیناتوم و 4 نمونه از 7 نمونه DNA هیالوما آناتولیکم نشان داد. با توجه به نتایج بدست آمده بنظر می رسد هیالوما مارژیناتوم و هیالوما آناتولیکم اهمیت بیشتري در انتقال بابزیا اویس در گوسفندان این منطقه داشته باشند
مقدمه:
بابزیوز یکی از بیماریهاي مهم تک یاخته اي در گوسفندان می باشد که توسط کنه سخت منتقل می شود و با علائم تب، کم خونی ، زردي ، لاغري، همگلوبینوري و مرگ ومیر بروز می نماید. - 1و. - 4 بابزیا اویس و بابزیا موتازي بعنوان گونه هاي بیماري زا و شایع در گوسفندان و بز هاي ایران شناخته شده اند . - 6 - مطالعات انجام شده در ایران نشاندهنده شیوع نسبتا بالاي بیماري در ایران است.
شناسایی کنه هاي سخت ناقل بیماري در هر منطقه اهمیت فراوانی در کنترل و پیشگیري بیماري دارد. تاکنون مطالعات اندکی در این باره صورت گرفته است. رزمی و همکاران با استفاده از رنگ آمیزي تعداد زیادي از گسترش هاي تهیه شده از همولنف و تخم کنه هاي ماده خونخورده، توانسند آلودگی کنه هاي رپی سفالوس سینگوینوس و هیالوما مارژیناتوم را به اووکینت بابزیا به اثبات برساند
باین وجود ، بعلت انتقال ارثی بابزیا در کنه طی نسلهاي متوالی بدون دخالت میزبان مهره دار و وجود چند گونه بابزیا در گوسفند ، نقش هر یک از این کنه ها بدرستی در انتقال بابزیا اویس بعنوان گونه شایع در بین گوسفندان این منطقه مشخص نگردید. بهمین دلیل در این مطالعه با استفاده از روش حساس و دقیق PCR ، نقش کنه هاي الوده کننده گله هاي گوسفند شهرستان مشهد در انتقال بابزیا اوویس مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها:
در این مطالعه طی فصول بهار و تابستان سال 1385 ، کنه هاي سخت از روي بدن 27 راس گوسفند مشکوك به بابزیا جمع آوري شد. همزمان نسبت به خونگیري از ورید وداج و تهیه گسترش خونی نازك از ورید گوش گوسفندا ن اقدام گردید. در آزمایشگاه انگل شناسی، ابتدا گسترش هاي خونی با گیمسا رنگ آمیزي شد و از نظر آلودگی به بابزیا اویس با استفاده از میکروسکوپ نوري مورد بررسی قرار گرفتند . علاوه بر این ، نمونه هاي کنه جمع آوري شده با کمک لوپ حشره شناسی وبراساس کلید تشخیص کنه ها - - 7 مورد شناسایی قرار گرفتند .
آنگاه کنه هاي واجد جنس و گونه مشابه در ظروف جداگانه قرار گرفتند . در مجموع 40 نمونه حاوي کنه یکسان تهیه شد . پس از زدن برچسب ، نمونه هاي کنه تا هنگام استخراج DNA در فریرزر منهاي 20درجه سانتیگراد قرار گرفتند. هنگام استخراج DNA ، نمونه هاي کنه از فریزر خارج و در یک هاون استریل واجد PBS خرد گردید. محتویات خرد شده کنه از صافی استریل عبور داده شد تا کوتیکول و بافتهاي سخت کنه جدا شود. سپس DNA مایع بدست آمده، بوسیله کیت تجاري - شرکت سینا ژن - طبق دستور کار شرکت سازنده استخراج شد. آنگاه کمیت و کیفیت DNA بوسیله الکتروفورزیس و با کمک دستگاه UV لومیناتور بررسی گردید. نمونه هاي DNA استخراج شده تاهنگام عملیات .PCRبه فریرزر منهاي 20درجه سانتیگراد منتقل شدند.
برمبناي مطالعات انجام شده قبلی در باره بابزیا اوویس در گوسفند 2 - و - 5، دو پرایمراختصاصی
پرایمر اول : R: 5′-CCGCGTAGCGCCCGGCTAAATA-3′ و F: 5′-TGGGCAGGACCTTGGTTCTTCT -3′
پرایمر دوم: R: 5′-GCTCAAAACCCTGGTCG -3′ و F: 5′-GCGACGAATCCTTGTGGCAC-3′ براي این منظور طراحی گردید . ابتدا عملیات PCR بر روي کنترل مثبت انجام گردید ، که پرایمر 1 پاسخ مناسبی به نمونه هاي مثبت داد
بهمین دلیل عملیات PCR بر روي نمونه هاي DNA کنه با استفاده از پرایمر 1 انچام گرفت. بطور خلاصه سیستم واکنش PCR براي حجم 50 میکرو لیتر طراحی شده بود. اجزاي واکنش PCR و حجم هر یک به ترتیب : 2/5 میکرو لیتر PCR buffer ، 0/5 میکرولیتر dNTP، یک میکرولیتر Mg Cl 2، 1/25 میکرولیتر پرایمر F ،1/25 میکرولیتر پرایمرR ، 0/2 میکرولیتر Tag DNA polymerase، 1/33 میکرولیتر آب دیونیزه استریل و 5 میکرولیتر DNA استخراجی از نمونه بودند.
پس از تهیه این مخلوط ، نمونه ها در دستگاه ترمال سیکلر گذاشته شد و جهت 35 سیکل ، زمان و درجه حرارت لازم دستگاه به شرح ذیل تنظیم گردید. هر سیکل PCR شامل 95 درجه سانتیگراد بمدت 5 دقیقه و94 درجه سانتیگراد بمدت یک دقیقه براي Denaturation time ، 52 درجه سانتیگراد براي Annealing time، 72 درجه سانتگراد بمدت 1دقیقه براي Extention time بود. در پایان محصول PCR برروي ژل آگاروز 2 درصد الکتروفورز شده ، سپس ژل با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي و با دستگاه UV لومیناتور با اشعه UV بررسی و عکس برداري شد.
نتایج و بحث :
در این مطالعه با استفاده از پرایمر اختصاصی اول، 40 نمونه DNA کنه مورد آزمایش PCR قرار گرفت . از مجموع 20 نمونه DNA رپی سفالوس سینگوینوس 2 نمونه ، از 13 نمونهDNA هیالوما مارژیناتوم 7 نمونه و از 7 نمونه DNA هیالوما آناتولیکم 4 نمونه ، باند مثبت 550 bp را براي بابزیا اوویس نشان دادند.
تصویر -1 نتایج آزمایش PCR بر روي 15 نمونه کنه در ژل آگار%2، وجود باند DNA به اندازه 550bp در نمونه هاي 5، 12، 13، 14 ، 15 و عدم تکثیر ان در سایر نمونه ها ، ستون M - مارکرمولکولی، . - Ladder 100 نمونه 5 مربوط به DNA رپی سفالوس سینگوینوس ، نمونه 12 مربوط به DNA هیالوما مارژیناتوم، نمونه 13، 14و 15 مربوط به DNA هیالوما آناتولیکم دردهه اخیر محققین با استفاده از تکنیک PCR توانستند کنه هاي ناقل تیلریا و بابزیا را در گوسفند ،گاو و اسب را شناسایی نمایند
با توجه به اهمیت گونه بابزیا اویس در گوسفندان ایران، در این مطالعه نیز سعی گردید کنه هاي ناقل بابزیا اوویس در گوسفند با روش PCR مورد شناسایی قرار گیرد. با توجه به نتایج موفقت آمیز مطالعات حبیبی و همکاران - 5 - و اکتاس و همکاران - 2 - در شناسایی بابزیا اوویس در خون گوسفندان آلوده ، ازدو پرایمر اختصاصی جهت این مطالعه استفاده شد . با توجه به نتایج رضایت بخش PCR با پرایمر اختصاصی اولی، نمونه هاي DNA کنه با این پرایمر مورد آزمایش قرار گرفتند . نتایج بدست آمده کاملا با نتایج اکتاس و همکاران - 2 - منطبق بود ، در نمونه هاي مثبت باند اختصاصی 550 bp بابزیا اویس مشاهده گردید.
در این مطالعه ، در نمونه هاي DNA هر سه کنه رپی سفالوس سینگوینوس ، هیالوما مارژیناتوم و هیالوما
آناتولیکوم واکنش مثبت در آزمایش PCR مشاهده شد که نشاندهنده اهمیت نقش هر سه کنه در انتقال بابزیا
اویس می باشد. اخیرا شایان و همکاران - 2007 - نیز با استفاده از تکنیک PCR نقش گونه هاي مختلف جنس رپی سسفالوس را در انتقال بابزیا اویس در ایران به اثبات رسانده اند . باتوجه به نتایج بدست آمده در این مطالعه ، بنظر می رسد کنه هاي هیالوما مارژیناتوم و هیالوما مارزیناتوم نقش بیشتري در انتقال بابزیا اویس در گوسفندان این منطقه داشته باشند.
