بخشی از مقاله
چکیده
در میان آنزیمها، آنزیم لیپاز بعنوان آنزیمی لیپولیتیک کاربرد وسیعی در صنعت دارد. شرایط و خصوصیات محیط کشت براي تولید بهینه لیپاز بیرون سلولی از Aspergillus niger NCIM 584 مورد بررسی قرار گرفت. آنزیم در حالت تخمیر غوطهور با استفاده از سوبستراي اصلی آرد سویا تولید شد. بهترین غلظت روغن زیتون، گلوکز و درصد وزنی آرد سویا براي تولید لیپاز بترتیب 12 - g/l - ، 12/5 و 7/5% بدست آمد. ترکیب دو منبع نیتروژنی عصاره مخمر و پپتون در غلظت 0/5 - g/l - بعنوان بهترین منبع نیتروژنی انتخاب شد. فعالیت آنزیمی در حضور یون کلسیم در غلظت 7/5 mM بیشترین مقدار را نشان داد.
مقدمه
لیپازها - تري آسیل گلیسرول آسیل هیدرولازها - - - Ec 3.1.1.3 بیوکاتالستهایی هستند که در سطح مشترك آب-چربی بر روي پیوندهاي آسیل گلیسرول تاثیر گذاشته و منجر به آزاد شدن اسیدهاي چرب و گلیسرول میشوند و حلالیت کمی در آب دارند، در کنار کاتالیزور واکنشهاي هیدرولیز، در محیط هاي کم آب لیپازها قادر به انجام واکنش معکوس نیز میباشند و در این شرایط واکنشهاي استریفیکاسیون، ترنساستیفیکاسیون و همچنین سنتز پپتیدها را انجام میدهند از منابع تولید کننده لیپاز میتوان به گیاهان، حیوانات و میکروارگانیسمها اشاره نمود اما لیپازهاي میکروبی نقش مهمی در صنعت دارند. از میان میکروارگانیسمهاي تولید کننده لیپازها قارچها به دلیل بازیابی و خالص سازي آسانتر و فعالیت لیپولیتیکی و تولید آنزیم بیشتر منابع مناسبتري محسوب میشوند.
هدف از تحقیق حاضر بررسی شرایط محیطی بر روي تولید لیپاز توسط گونه آسپرژیلیوس نایجر در حالت تخمیر غوطهور توسط سوبستراي آرد سویا به منظور رسیدن به بیشترین فعالیت لیپولیتیکی می باشد.
.2 مواد و روش ها
در این پژوهش میکروارگانیسم Aspergillus niger NCIM 548 مورد استفاده قرار گرفت، که از مجموعه ملی میکروارگانیسمهاي صنعتی در هند تهیه و بر روي اسلنت آگار و در دماي 4 درجه سانتی گراد ذخیره و نگهداري شد.
محیط کشت جهت تخمیر لیپاز شامل: گلوکز، روغن زیتون، پتاسیم دي هیدروژن فسفات، سولفات منیزیم 7 آبه، پتاسیم کلراید، عصاره مخمر و پپتون با غلظت - g/l - به ترتیب 12/5، 12، 2، 0/5، 0/5، 0/25و 0/25 است. آرد سویا به عنوان سوبستراي اصلی با 7/5 به محیط کشت اضافه میشود.
براي تولید آنزیم، پس از تلقیح میکروارگانیسم از یک اسلنت آگار 6 روزه در شرایط استریل، محیط کشت استریل درون شیکر انکوباتور در دماي 32 و دور 180 به مدت 96 ساعت جهت تخمیر و تولید آنزیم لیپاز قرار گرفت. در پایان دوره تخمیر نمونه درون ارلنمایر را توسط فیلتر کاغذي واتمن - شماره - 41 به روش خلاء فیلتر نموده و مایع فیلتر شده را به مدت 5 دقیقه درون سانتریفوژ با دور 10000 قرار گرفت و مایع شفاف آنزیمی بدست آمد.
فعالیت آنزیمی توسط روش اسپکتروفتومتري توسط سوبستراي پارا نیتروفنیل پالمیتات اندازه گیري شد. مخلوط واکنش در دماي 30 به مدت 5 دقیقه در حمام آب گرم قرار میگیرد، پس از اتمام مدت آزمایش مقدار پارانیتروفنل آزاد شده را در 410 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتري بر طبق روش ارائه در مقالات انجام می شود.[5] یک واحد فعالیت لیپاز - U - مقدار آنزیمی است که یک میکرومول پارانیتروفنل را در هر دقیقه تحت شرایط استاندارد آزمایش آزاد می کند.
.3بحث و نتیجه گیري بررسی اثر غلظت آرد سویا:
آرد سویا ماده اي مغذي و غنی از پروتئین، چربی و مواد معدنی است. براي بررسی اثر غلظت آرد سویا غلظتهاي مختلف آن از 7/5 تا 12/5آزمایش شد، سایر شرایط محیط کشت شامل غلظت روغن زیتون، گلوکز و عصاره مخمر به عنوان منبع نیتروژنی به ترتیب 10 - g/l - ، 10 و 0/5 می باشد. در این حالت pH محیط کشت 7 و دما 32 می باشد. شکل 1 فعالیت نسبی آنزیم نسبت به آرد سویا را نشان می دهد. در این بررسی بیشترین فعالیت لیپولیتیکی در غلظت 7/5% از آرد سویا مشاهده شد.
شکل :1 بررسی اثر غلظت آرد سویا بر روي فعالیات نسبی لیپاز
تاثیر غلظت روغن زیتون بر روي تولید آنزیم: وجود منبع کربنی چرب در ترکیب محیط کشت، براي تولید لیپاز لازم و ضروري است، بدین منظور می توان از اسیدهاي چرب، روغن گیاهان و ... استفاده نمود .[6] در این آزمایش غلظتهاي متفاوت روغن زیتون در رنج 3 - g/l - تا 15 - g/l - مورد بررسی قرار گرفت. در این حالت محیط کشت شامل آرد سویا با غلظت 7/5%، گلوکز با غلظت 10 - g/l - ، عصاره مخمر به عنوان منبع نیتروژنی با غلظت ./5 - g/l - بود.
pH محیط کشت بر روي 7 و دماي انکوباسیون 32 تنظیم شد.آنچنانکه در شکل شماره 3 مشاهده می شود بیشترین فعالیت آنزیمی در غلظت 12 - g/l - روغن زیتون بدست آمد. فالونی و همکارانش[7] آزمایشاتی که با استفاده از سوبستراي سبوس گندم توسط ارگانیسم آسپرژیلیوس نایجر J-1در حالت تخمیر بستر جامد انجام دادند، بیشترین فعالیت آنزیمی را در غلظت روغن زیتون 15 - g/l - گزارش کردند. در مطالعه اي دیگر، تولید آنزیم لیپاز توسط ارگانیسم آسپرژیلیوس نایجر AC-54 در شرایط مشابه صورت گرفت. بر طبق نتایج حاصل شده غلظت بهینه براي روغن زیتون در 16 - g/l - بدست آمد.[8] می توان به این نتیجه رسید که غلظت روغن زیتون براي تولید آنزیم لیپاز از فاکتورهاي تأثیرگذار میباشد.
شکل :3 بررسی اثر غلظت روغن زیتون بر روي فعالیات نسبی لیپاز تأثیر غلظت گلوکز در تولید آنزیم: گلوکز به عنوان منبع کربنی مکمل به محیط کشت اضافه میشود.
براي بررسی تاثیر غلظت گلوکز، محیط کشتهایی شامل آرد سویا با غلظت 7/5wt%، روغن زیتون 12 - g/l - ، عصاره مخمر 0/5 - g/l - و گلوکز در رنج غلظتی 5 تا 15 - g/l - تهیه شد، آزمایش در دماي 32 انجام شد. نتایج نشان داد که بیشترین فعالیت آنزیمی در غلظت گلوکز 12/5 g/l میباشد - شکل . - 4 با بررسی مطالعات مشابه ماکزیمم فعالیت آنزیمی در حالت تخمیر شناور توسط ارگانیسم آسپرژیلیوس نایجرNRRL3 غلظت بهینه گلوکز 20 - g/l - گزارش شده است.[9] فالونی و همکارانش[7] نیز با ارگانیسم آسپرژیلیوس نایجرJ-1 در حالت بستر جامد با سوبستراي سبوس گندم غلظت بهینه گلوکز 15 - g/l - گزارش نمودند.
شکل :4 بررسی اثر غلظت گلوکز بر روي فعالیات نسبی لیپاز
بررسی تأثیر منابع نیتروژنی:منابع نیتروژنی آلی و غیرآلی نقش مهمی را در سنتز لیپاز ایفا میکنند، عموما منابع نیتروژنی آلی بازده بالاتري از تولید لیپاز را نشان میدهند .[4-2] در این بررسی تأثیر منابع نیتروژنی متفاوت مانند عصاره مخمر، پپتون، مخلوط عصاره مخمر و پپتون، اوره و آمونیوم کلراید در محیط کشت با غلظت ثابت 0/5 - g/l - بر روي فعالیت نسبی آنزیم بررسی شد - شکل . - 5 سایر شرایط محیط کشت شامل غلظت روغن زیتون، گلوکز و آرد سویا به ترتیب - 12 - g/l، 12/5 و 7/5% می باشد. شکل 5 نشان می دهد استفاده از مخلوط عصاره مخمر و پپتون به عنوان منبع نیتروژنی منجر به بیشترین فعالیت آنزیمی میشود.
شکل :5 بررسی اثر منبع نیتروژنی بر روي فعالیات نسبی لیپاز
