بخشی از مقاله
چکیده
سفیدبالک Bemisia tabaci ناقل یکی از مهمﱰین ویروسهاي گوجهفرنگی بهنام ویروس پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی - - TYLCV است. در این بررسی جذب و پایداري سویه ایرانی جدید ویروس TYLCV در بدن حشره ناقل و قدرت آلوده کنندگی آن آه در اپیدمی و شیوع بیماري نقش مهمی دارند، با استفاده از PCR مطالعه شده است. نتایج این ﲢقیق نشان داد که یک ساعت پس از تغذیه حشره ناقل از گیاه آلوده گوجه فرنگی، ویروس TYLCV در بدن ناقل قابل ردیابی بوده و تا آخرین مراحل زندگی حشره ﲟدت 12 روز ردیابی مولکوﱄ آن با PCR امکان پذیر است. این درحاﱄ است آه حشرات ناقل تنها تا چهار روز پس از آسب ویروس قدرت آلودهآنندگی خود را حفظ میآند. بنابراین وجود DNA ویروس TYLCV در بدن حشره ضرورتا" به معﲏ قدرت آلودهسازي آهنا نیست.
مقدمه
ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی - Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV - از اعضاء جنس Begomovirus و خانوادهGeminiviridae از عوامل اصلی کاهش دهنده ﳏصول گوجه فرنگی است. در ایران ویروس TYLCV در سال 1375 توسط حاجی مراد و ﳘکاران گزارش شد - . - 3 ویروس TYLCV داراي یک یادوقطعه DNA تک رشتهاي به اندازه 2730 تا 2810 نوکلئوتید بودهکه تنوع ژنتیکی زیادي را نشان میدهد. این ویروس به طورمکانیکی قابل انتقال نبوده و به وسیله بیوتیپ هاي B و Q حشره سفیدبالک - Homoptera, Aleurodidae - Bemisia tabaci به روش پایا، چرخشی و غﲑ تکثﲑي منتقل می شود 2 - و . - 8
مطالعه ﳓوه انتقال ویروس توسط سفیدبالک و جذب و پایداري ویروس در بدن حشره از نظر گسﱰش اپیدمی بیماري حائز اﳘیت زیادي است.در بررسیهاي قبلی زمان لازم براي جذب TYLCV از گیاه آلوده و پایداري آن در بدن حشره از جدایهاي به جدایه دیگر متفاوت گزارش شده است. زمان لازم براي جذب ویروس از 20 تا 60 دقیقه - 4 و - 6 و پایداري ویروس دربدن ناقل از 10 تا 12 روز گزارش شده است . - 5 - در این ﲢقیق ویژگیهاي مهم اپیدمیولوژي سویه جدید ایرانی ویروس TYLCV شامل حداقل زمان جذب، پایداري DNA و قدرت آلودهسازي آن در حشره ناقل مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها ایرانی ویروس TYLCV-Ir2 موردگیاهان آلوده به جدایه جدید استفاده در این مطالعه از مزارعگوجه فرنگی در استان هرمزگان - بندرعباس - ﲨع آوري گردیده و تشخیص آلودگی آهنا به TYLCV از طریق انتقال آلودگی در گلخانه به گیاهان ساﱂ گوجهفرنگی و مشاهده علائم بیماري اﳒام شد. براي انتقال ویروس بیوتیب B حشره سفیدبالک - B. tabaci - براساس ویژگیهاي مرفولوژیک شناسایی و ﲨع آوري شده و روي گیاه گل آلم - - Brassica oleracea پرورش پیدا آردندتا پس از دو نسل عاري ازویروس شوند.براي بررسی مدت زمان لازم تغذیه سفیدبالک از گیاه آلوده، سفیدبالکهاي ساﱂ به روي گیاه گوجه فرنگی آلوده به ویروس منتقل شده و در زماهناي 10 دقیقه، 20 دقیقه، 1،4، 24، 48 ساعت پس از تغذیه DNA این سفید بالکها استخراج و PCR اختصاصی صورت گرفت.
جهت بررسی پایداري ویروس در بدن ناقل،حشرات سفیدبالک پس از تغذیه 48ساعته آهنا از گیاه آلوده،به روي گیاه کلم گل - Brassica oleracea - عاري از سفیدبالک منتقل شده ودر مدت زماهناي 4، 6، 8، 10 و 12 روز بعد از انتقال آهنا به روي گیاه کلم گل DNA آهنا استخراج شده و PCR صورت گرفت. از هر یک ازگروههاي حشرات آلوده و نگهداري شده بر روي گیاهان آلمگل ساﱂ زماهنا 40 تا 50 حشره سفیدبالک به روي گیاهچه گوجه فرنگی ساﱂ رقم PS111 منتقل شده و به آهنا اجازه داده شد تا دو روز ازاین گیاهچه ها تغذیه کرده و سپس با سم کنفیدور سم پاشی شدند،سه و چهار هفته بعد از این گیاهچه ها DNA استخراج شده و برايPCR اختصاصی تشخیص ویروسTYLCV استفاده شد.
ﳘچنﲔ شش هفته بعدگیاهچه هاي تغذیه شده با حشرات آلودهاي آه 4 و 12 روز بر روي گیاهان آلمگل ساﱂ مانده بودند به عنوان منبع آلودگی براي اﳒام آلوده سازی برگشتی - Back inoculation - استفاده شد. حشرات ساﱂ سفیدبالک پس از 48 ساعت تغذیه از این گیاهان براي آلودهسازي گیاهچههاي ساﱂ گوجه فرنگی ﳘان رقم استفاده شدند. سه هفته بعد این گیاهان براي وجود TYLCV با واآنش PCR تست شدند.استخراج DNAي آل حشره آلوده با استفاده از روش Aljanabi و ﳘکاران - - 1 و استخراج DNA کل گیاه براساس روش تغیﲑ یافته Dellaporta و ﳘکاران - - 7 اﳒام گرفت. با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ویروس - 7 - TYLCV با توالیهاي Sense:5′-CGC CCG TCT CGA AGG TTC-3′ و Antisense: 5′-GCC ATA TAC AAT AAC AAG GC-3′ و آنﱰل داخلی از ژن ریبوزومی 18s گوجه فرنگی-18s Forward: 5′ -TTG ACT GGT GAA TCT CTT CCT 3′ و 18s Reverse: 5′-CAC CAA TGA GAA GGA CAA GA-3′ استفاده شد.
نتایج و ﲝث
آلودگی گیاهان گوجهفرنگی منطقه بندرعباس به TYLCV با استفاده از PCR و آغازگرهاي اختصاصی ویروس TYLCV اثبات گردید و یک قطعه DNA ویروسی مورد انتظار به اندازه 670bp تکثﲑ گردید. در سفیدبالک آلوده، گیاهان آلوده شده توسط سفیدبالک آلوده و گیاهان آلوده شده با پیوند نیز ﳘﲔ قطعه DNA تکثﲑ شد. درحاﱄ که این قطعه DNA در هیچکدام از حشرات ساﱂ، گیاه ساﱂ گوجهفرنگی و گیاهان کلمگل که ناقل روي آهنا پرورش یافته بود، تکثﲑ نگردید. یک ساعت بعد از تغذیه ناقل از بوته آلوده، قطعه اختصاصی ویروس TYLCV به اندازه 670bp در بدن حشرات B. tabaci قابل تکثﲑ بود درحاﱄ که در حشراتی که تنها به مدت 10 و 20 دقیقه از گیاهان آلوده تغذیه کرده بودند این قطعه DNA تکثﲑ نشد - شکل1 الف - .
این موضوع نشان داد آه 20 دقیقه براي جذب ویروس آاﰲ نیست. نگهداري حشرات آلوده در روي گیاهان عاري از ویروس آلمگل براي مدت زماهناي متفاوت نشان داد آه DNA ویروس TYLCV تا 12 روز پس از جذب ویروس - - Day post acquisition period, DPA با استفاده از PCR اختصاصی قابل ردیابی است - شکل1 ب - . این درحاﱄ بود آه این حشرات سفیدبالک فقط تا آمﱰ از 6 روز قدرت آلودهآنندگی خود رانیز حفظ آردند - شکل 2 الف - . بطوريآه در گیاهان مایه زنی شده با حشرات آلوده پس از چهار روز نگهداري بر روي گیاه آلمگل یک باند قوي DNA ویروسی و علائم شدید بیماري مشاهده گردید.
در آزمون مایهزنی برگشﱵ سه هفته بعد از آلوده سازي، قطعه DNA ویروسی در گیاهان مایه زنی شده با حشرات آلوده پس از چهار روز تکثﲑ شد درحاﱄ که در گیاهان مایه زنی شده با حشرات آلوده پس از شش روز DNA ویروسی ردیابی نشد - شکل2 ب - . بنابراین میتوان نتیجه گرفت آه ردیابی DNA ویروس TYLCV در بدن حشرات آلوده ضرورتا" به معﲏ قدرت آلوده آنندگی آهنا نیست. شکل-2 الف - ردیابی ویروس در گیاهان گوجهفرنگی آلودهشده با حشرات ناقل bpپس250 از طی مدت بزماهناي ﳐتلف دورماندن از منبعالفویروس، چهار هفته پس از آلوده سازي - الف - . قطعه 670 bp قطعه DNA ویروسی و قطعه 406 bp قطعه DNA ریبوزومی 18s بعنوان آنﱰل داخلی است. - 1 - مارآر 100 bp بوده و نوارهاي بعدي شامل گیاهان آلوده بوسیله حشرات ناقل به ترتیب بعد از چهار روز - - 2، شش روز - 3 - ، هشت روز - 4 - ، ده روز - - 5 و دوازده روز - - 6، از دوري از منبع آلودگی می-باشد ب - ردیابی ویروس در گیاه آلوده جدید پس از اﳒام آزمون آلودگی برگشﱵ از گیاهان آلوده شده با حشرات ناقل 4 روز پس از آسب ویروس - - 2 و شش روز پس از آسب ویروس - - 3 در آنار مارآر - 1 - DNA 100bp
