بخشی از مقاله
چکیده
بیماري هاي ویروسی به طور متوسط قادرند باعث کاهش محصول سیب زمینی تا %50 شوند. ویروس هاي Potato virusY , PVY - Y - ، Potato virus - X - X, PVX، پیچیدگی برگ - Potato leafroll virus, PLRV - ، - Potato virus M, PVM - M و - Potato virus S, PVS - S از رایج ترین ویروسهاي سیب زمینی به شمار می روند. با توجه به تولید غده هاي بذري در داخل کشور و آلودگی اغلب مناطق کشور، کنترل و صدور گواهی سلامت غده هاي بذري براي کاشت، معرفی یک روش دقیق، حساس، سریع و ارزان براي ردیابی همزمان ویروس هاي سیب زمینی بسیار ضروري است. از این رو در این تحقیق پس از تشخیص غده هاي آلوده به ویروس با استفاده از آزمون الیزا، آر.ان.اي کل از گیاهان آلوده استخراج شد. سپس دي.ان.اي مکمل از روي آر.ان.اي استخراج شده ساخته شد. دي.ان.اي مکملِ ویروس واي، ویروس اس و18S rRNA با استفاده از تکنیک Multiplex PCR به صورت همزمان تکثیر شدند.
مقدمه
سیب زمینی - Solanum tuberosum - یکی از محصولات مهم ایران و جهان می باشد. هر ساله مقداري از این محصول مهم اقتصادي توسط آفات و بیماري ها از بین می رود و از این میان بیماري هاي ویروسی یکی از مهم ترین عوامل کاهش محصول به شمار می روند - . - 1 تا کنون 35 ویروس سیب زمینی از نقاط مختلف دنیا گزارش شده است - . - 2 ویروس - Potato virusY, PVY - Y با%80 ، ویروس - Potato virus X, PVX - X با %50 ، ویروس پیچیدگی برگ - Potato leafroll virus, PLRV - به طور متوسط با %15 تا حداکثر %90، ویروس - Potato virus M, PVM - M و ویروس - Potato virus S, PVS - S با %10-20 خسارت، از مهمترین ویروسهاي سیب زمینی به شمار می روند - . - 1
میزان آلودگی این ویروسها در ایران در مناطق مختلف کاشت سیب زمینی مطالعه وگزارش شده است: در استان خوزستان آلودگی به ویروس Y سیب زمینی - PVY - تا %74 ، ویروسS سیب زمینی - - PVS تا %68 ، ویروس X سیب زمینی - - PVX تا%44 ، ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی - PLRV - تا %25 ،ویروسM سیب زمینی تا %22 گزارش شده است - . - 3 در منطقه کرمان میزان آلودگی به ویروسPVY تا %10/8 ، ویروس %0/83 PVS و ویروس %15/8 PVA تعیین شده است - . - 4 ویروسPVY شایعترین ویروس مزارع سیب زمینی در استان خراسان، گیلان و مازندران می باشد - . - 5 بعلاوه این ویروس از استان هاي اصفهان و همدان نیز گزارش شده است - . - 6 همچنین ویروس PVX از خراسان و اردبیل گزارش شده است - . - 7
بر خلاف اکثر عوامل بیماري زا، ویروس هاي سیب زمینی می توانند بدون ایجاد هر گونه علامتی در گیاه باعث خسارت شوند - . - 8 با توجه به تولید غده هاي بذري در داخل کشور وآلودگی اغلب مناطق کشور، کنترل و صدور گواهی سلامت غده هاي بذري براي کاشت، اجتناب ناپذیر است. از این رو معرفی یک روش دقیق، حساس، سریع و ارزان براي ردیابی همزمان ویروس هاي سیب زمینی بسیار ضروري است. در این تحقیق روش Multiplex PCR براي تشخیص همزمان چند ویروس رایج مزارع سیب زمینی ایران مانند: PVX , PVY, PLRV, PVM , PVS به کار گرفته شد.
مواد و روشها
.1به منظور پیدا کردن منابع آلودگی، غده هاي سیب زمینی مشکوك به آلودگی کاشته شده و پس از سبز شدن با استفاده از آزمون الیزا و پنج آنتی بادي علیه ویروس هاي PVY, PVX, PLRV, PVS, PVM بررسی شدند. آزمون الیزا به روش کلارك و آدامز - - 9 انجام گرفت.
.2 استخراج RNA کامل از برگهاي گیاهان آلوده با استفاده از کیت RNx Plus - خریداري شده از شرکت سیناژن - انجام گرفت.
.3 واکنش نسخه برداري معکوس با استفاده از کیت Fermentas و مطابق با دستور العمل شرکت سازنده ساخته شد. محصول مرحله قبل به همراه مواد لازم به منظور ساخت رشته مکمل دي. ان. ا به مدت یکساعت در دماي 42 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
.4 تکثیر توالی هاي ویروسی و ژن کنترل داخلی با استفاده از واکنش هاي زنجیره اي پلیمراز با آغازگرهاي اختصاصی ویروس هاي PVS , PVY و 18S rRNA انجام شد. واکنش در دستگاه ترموسایکلر - Eppendorf، ساخت کشور آلمان - و با برنامه دمایی 94 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه و 35 چرخه در دماي 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه, 58 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد به مدت 25 ثانیه انجام گردید و در نهایت به مدت 5 دقیقه در دماي 72 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
.5 آنالیز محصول 5 :PCR میکرولیتر از محصول PCR در ژل آگارز%2/5 و بافر TBE تفکیک و عکسبرداري از باندهاي تشکیل شده انجام گرفت.
نتایج وبحث:
با استفاده از روش مولکولی Multiplex-RT-PCR و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی، تاکنون ویروس واي و اس سیب زمینی و 18S rRNA در گیاهان آلوده به صورت جدا و همزمان ردیابی شدند. محصول واکنش Multiplex-RT-PCR براي دو ویروس و RNA یاد شده روي ژل آگارز %2/5 تفکیک شد و در یک ردیف سه باند 255bp مربوط به آر.ان.اي ریبوزومی، 342bp مربوط به ویروس S سیب زمینی، 142bp مربوط به ویروس Y سیب زمینی مشاهده شد - شکل. - 1 تکثیر RNA ي گیاهی به عنوان کنترل داخلی از بروز نتایج منفی کاذب جلوگیري می کند. بنابراین در این تحقیق از 18S rRNA به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. تلاش ما این است که حداقل پنج ویروس رایج در مزارع سیب زمینی کشور را به طور همزمان با روش Multiplex-RT-PCR تشخیص دهیم. تحقیقات بیشتر براي دستیابی به این روش در حال انجام است.
