بخشی از مقاله
چکیده
با توجه به میزان خسارت ناشی از بیماریهای قارچی، استفاده از روشهای بیوتکنولوژی به منظور تولید گیاهان مقاوم از جایگاه ویژهای برخوردار است. پژوهش حاضر با هدف جداسازی و همسانهسازی ژن Ap24 در ناقل pBI121 انجام گردید. در این تحقیق، پس از طراحی آغازگرهای اختصاصی، ابتدا ژن AP24 از ژنوم گیاه توتون توسط PCR جداسازی و در ناقل واسط pTZ57R/T کلون گردید. پس از آنالیزهای مربوط به صحت جداسازی ژن، با کمک آنزیمهای برشی ژن مجدداً از ناقل خارج و تحت پیشبر 35S و پایاندهنده Nos در ناقل pBI121 کلونسازی شد. ناقل تهیه شده را میتوان برای انتقال ژن به گیاهان مختلف مورد استفاده قرار داد.
مقدمه
مبارزه با عوامل بیماریزا میتواند به میزان بسیار زیادی سطح تولید را افزایش داده و خسارتی معادل 220 میلیارد دلار در سال را به میزان چشمگیری کاهش دهد . - Agrios, 2005 - یکی از این عوامل، قارچهای بیماریزا میباشند. در حال حاضر، مبارزه با بیماریهای قارچی به روشهای مختلفی از جمله مبارزه زراعی، تولید ارقام مقاوم به قارچ به دو طریق اصلاح کلاسیک و بیوتکنولوژی مدرن - دستورزی ژنتیکی - ، مبارزه بیولوژیک و مبارزه شیمیایی قابل انجام است و از آنجایی که برنامههای اصلاح سنتی جهت تولید گیاهان مقاوم به قارچ براساس فنون زمان بر و طولانی استوار بوده و به ندرت میتوانند با تکامل سریع عوامل بیماریزا کنار بیایند، بنابراین کشاورزان اغلب ناچار به استفاده از سموم شیمیایی میباشند که پرهزینه بوده، به شدت باعث آلودگی محیط زیست شده و بالاخره در اثر جهش تأثیر سموم بر عوامل بیماریزا کم اثرتر میگردد.
در حال حاضر اکثر استراتژیها برای تولید گیاهان تراریخته مقاوم به بیماریهای قارچی، روی معرفی ژنهای کدکننده پروتئینهای ضد میکروبی PR و یا سایر پروتئینهای ضد میکروبی که فعالیت بیولوژیکی آنها هنوز معلوم نبوده، متمرکز شده است. ژنهای مرتبط با بیماریزایی - PR - ، ژنهایی میباشند که بیان آنها سبب القاء پاسخ فوق حساسیت به بسیاری از آلودگیهای ویروسی، قارچی و باکتریایی می گردد . - Edreva, 2005 - از زمان کشف آنها در سال 1970 در برگهای تنباکو و در پاسخ فوق حساسیت به TMV1 - ویروس موزائیک تنباکو - تا کنون، پروتئینهای مرتبط با بیماریزایی مورد توجه بسیار قرار گرفتهاند . - Datta et al., 1999 -
تاکنون -PRپروتئینها بر مبنای ساختار و توالیهای مشابه به 17 خانواده اصلی تقسیم بندی شدهاند - Vidhyasekaran, P. . - 2008 ژن Ap224 از ژنهای خانواده PR5 بوده که پروتئین Osmotin را سنتز میکند و با شماره 4097 در سایت NCBI ثبت گردیده است. هدف اصلی این پژوهش جداسازی ژن Ap24 از خانواده PR5 از ژنوم توتون که پروتئین ضد قارچی osmotin را سنتز میکند و کلونسازی آن در پلاسمید ناقل pTZ57R/T جهت افزودن سایت های برشی مورد نظر و تعیین توالی و بررسی صحت جداسازی و کلون سازی آن در پلاسمید باینری pBI121 جهت افزودن پیشبر CaMV35S و پایاندهنده Nos به آن و ایجاد پلاسمید نوترکیب pBI121-Ap24 به منظور استفاده در تراریزش گیاهان دولپه جهت ایجاد ارقام مقاوم به قارچ بود. همچنین میتوان با کمک آنزیم- های برشی ژن را از ناقل جدا و با سایر روشهای انتقال ژن به هر گیاه دلخواهی انتقال داد.
مواد و روشها
ابتدا با توجه به توالی شناسایی شده برای ژن Ap24 در گیاه توتون - Nicotina tobacco - اقدام به طراحی آغازگر اختصاصی با کمک نرم افزار Oligo Tech شد و سپس برای ساخت آغازگر به شرکت سینا ژن سفارش داده شد. در این فاصله از برگهای جوان گیاه اقدام به استخراج DNA به روش دلاپورتا و همکاران - 1983 - شد. از باکتری E-coli سویه XL1blue به منظور تهیه سلول های مستعدَ و سپس نگهداری پلاسمید های اصلی و نوترکیب استفاده شد. ژن Ap24 در پلاسمید کلونینگ PTZ57R کلون شد. برای کشت باکتری های E.coli از محیط - Lauri & Bertani - LB مایع و جامد استفاده شد. کیفیت و کمیت DNA استخراج شده - پلاسمیدی و کروموزومی - به ترتیب با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز - W/V - %0/8 -1 و اسپکتروفتومتری در طول موج های 260 و 280 nm تعیین شد.
پس از تکثیر ژن، محصول PCR از ژل بازیافت گردید. جهت آنکه در انتهای قطعات تکثیری نوکلئوتید A وجود داشته باشد، از آنزیم Taq DNA پلیمراز استفاده شد و همچنین زمان گسترش نهایی واکنش 10 - Final extension - دقیقه اعمال گردید. در کیت مربوط به T/A، این ناقل به صورت هضم شده وجود دارد به گونهای که در دو سر آن یک نوکلئوتید T به صورت انتهای چسبناک - Sticky - وجود دارد. به منظور انتخاب اولیه باکتریهای حاوی پلاسمید نوترکیب از محیط انتخابگر مک کانکی حاوی آمپیسیلین - 100 g ml-1 - استفاده شد. به منظور انتقال ژن به گیاه از طریق باکتری Agrobacterium tumefaciense، ژن در پلاسمید pBI121 کلون گردید.
به منظور کلون کردن، ژن Ap24 که در پلاسمید T/A کلون شده بودند، با هضم آنزیمی توسط آنزیمهای BamHI و SacI خارج شده و در پلاسمید pBI121 که با همین آنزیمها هضم شده بودند، کلون گردیدند. هضم آنزیمی ناقل pBI121 با این دو آنزیم موجب حذف ژن GUS میگردد. به منظور اطمینان از کلون شدن قطعات در pBI121 عمل هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم های BamHI و SacI انجام شد که باعث آزاد سازی قطعات حدود 800 bp گردید.
