بخشی از مقاله
چکیده:
فاکتور ﳏرکه کلنی گرانولوسیت انسانی - hG-CSF - سایتوکاینی است که موجب ﲢریک سلول های پیش ساز گرانولوسیت به تکثﲑ و ﲤایز و نیز فعال سازی سلول های رده گرانولوسیت، نوتروفیل بالغ می شود. امروزه این فاکتور گلیکوپروتئینی به صورت نوترکیب سنتز شده و در درمان انواع نوتروپنی به خصوص در افراد ﲢت شیمی درمانی سرطان، موارد پیوند مغز استخوان و... کاربرد دارد. تاﲝال ﳏققﲔ ﳐتلفی با اﳚاد برخی تغیﲑات در این فاکتور در جهت افزایش فعالیت یا پایداری و زمان ماندگاری آن تلاش کرده اند.تکنیک جهش زایی هدفدار بر پایه PCR و به روش Overlap Extension، طی شش مرحله و با شش پراﳝر ﳐتلف بر روی cDNA کلون شده این فاکتور اﳒام شد.
قطعه DNA حاصله سپس در وکتور pBlue script کلون شده و بعد از تایید تغیﲑات اعمال شده با توالی یابی، در وکتور بیانی pET21a، کلون شده و در باکﱰی - E.coli Bl21 - DE3 بیان گردید. سنجش پروتئﲔ حاصله نیز با الکﱰوفورز بر روی ژل پلی اکریلامید در حضور سدﱘ دودسیل سولفات - SDS-PAGE - و Western-Blot با استفاده از آنتی بادی منوکلونال ضد G-CSF اﳒام شده است.در این پژوهش با تلفیق مطالعات قبلی تلاش شد تا پروتئﲔ نوترکیبی تولید شود که نسبت به پروتئﲔ طبیعی افزایش قابل توجهی هم در فعالیت وهم در پایداری و زمان ماندگاری داشته باشد. سنجش فعالیت و پایداری این ﳏصول در مطالعات آینده اﳒام خواهد شد.
کلمات کلیدی:فاکتور ﳏرکه کلنی گرانولوسیت، جهش زایی هدفدار، کلونینگ
مقدمه:
تکثﲑ و ﲤایز سلول های خونی فرایندی بسیار پیچیده و به شدت تنظیم شده می باشدو ﲤام مراحل این فرایند ﲢت کنﱰل فاکتورهای اختصاصی با نام کلی سایتوکاین ها است. این فاکتورها گلیکوپروتئﲔ هایی هستند که بقا، تکثﲑ و ﲤایز سلول های پیش ساز خونی را کنﱰل کرده و بر روی عملکرد سلول های خونی نابالغ نیز تاثﲑگذارند.فاکتور ﳏرکه کلنی گرانولوسیت انسانی1، گلیکوپروتئینی با وزن مولکولی در حدود 20 کیلودالتون می باشد که دارای دو فرم hG-CSFa و hG-CSFb است. فرم a دارای 177 آمینواسید و فرم b دارای 174 آمینواسید است که تفاوت آهنا ناشی از پردازش متفاوت mRNA اولیه است. هردو فرم اثرات بیولوژیک مشاﲠی دارند ولی فعالیت فرم b در حدود 20 برابر بیشﱰ از فرم a است. ساختمان سوم این پروتئﲔ دارای چهار مارپیچ آلفاست که به صورت آنتی پارالل قرارگرفته اند.
زﳒﲑه قندی نیز به صورت -Oگلیکوزیلاسیون به ترئونﲔ 133 متصل می شود. - 12،11،6، - 3هم اکنون hG-CSF به کمک روش های بیوتکنولوژیک تولیدشده و در درمان انواع نوتروپنی به خصوص در افراد ﲢت شیمی درمانی و پرتودرمانی سرطان، موارد پیوند مغز استخوان و جداسازی سلول های بنیادی مغزاستخوان از خون ﳏیطی کاربرد دارد.پس از کلون کردن و بیان ژن این فاکتور - 12 - ﳏققﲔ ﳐتلفی انواع جهش یافته آن را تولید و بررسی ﳕودند، ازﲨله فرم kw-2228 که با تغیﲑ پنج آمینواسید در انتهای -N ترمینال hG-CSF حاصل شده و فعالیت بیولوژیکی2 دو تا چهار برابر بیشﱰ از پروتئﲔ طبیعی دارد. - 7 -
درمواردی نیز پژوهشگران با جهش زایی در hG-CSF، میزان بیان آن در E.coli، پایداری1، نیمه عمر و زمان ماندگاری آن را افزایش داده اند. - 10،9،5،4،2، - 1در ﲢقیقات به عمل آمده تاکنون، مطالعات جهش زایی یا در جهت افزایش فعالیت بیولوژیکی پروتئﲔ و یا افزایش پایداری و زمان ماندگاری آن بوده است. در این ﲢقیق برای اولﲔ بار تلاش شده است با تلفیق نتایج پژوهش های قبلی و اﳚاد چند سری موتاسیون هدفدار، hG-CSF نوترکیبی طراحی و سنتز شود که هم پایداری و هم قعالیت بیولوژیکی بالاتری نسبت به hG-CSF طبیعی داشته باشد. در ایران نیز ژن hG-CSF توسط سعیدی نیا و ﳘکاران کلون شده - 15 - ولی تاکنون مطالعات جهش زایی بر روی آن اﳒام نشده است.
مواد و روش ها:
تکنیک جهش زایی هدفدار2 برپایه PCR و به روش - 16 - Overlap Extension با استفاده از پراﳝرهای زیر و طی شش مرحله PCR اﳒام شد:
این پراﳝرها با توجه به کدون های ترجیحی باکﱰیE.coli و با کمک نرم افزار Gene Runner 3.05 طراحی و توسط شرکت سیناژن سنتز گردید. پراﳝر F دارای توالی شناسایی آنزﱘ NdeΙ و پراﳝر R دارای توالی شناسایی آنزﱘ XhoΙ و دنباله هیستیدینی می باشد که به ترتیب در انتهای 5’ و3’ ژن قرار می گﲑند. hG-CSF cDNA کلون شده در وکتور pBlue script به عنوان الگو استفاده شد.پس از اﳒام مراحل PCR با استفاده از آنزﱘ Pfu DNA pol. - Fermentas - آمپلیکون حاصله به روش Blunt End در وکتور پلاﲰیدی pBlue script برش خورده با آنزﱘ EcoR V کلون شده و تغیﲑات اعمال شده با توالی یابی تأیید شدند. قطعه هدف با کمک آنزﱘ های XhoΙوNdeΙ جداشده و پس از ﲣلیص، دروکتور بیانی pET21a کلون گردید. وکتور نوترکِب به باکﱰی E.coli BL21 - DE3 - منتقل شده وبا انکوباسیون درﳏیط LB broth دردمای37° سلسیوس و ﳘزن 250 rpm و با تلقیح IPTG - 1 mM - بیان پروتئﲔ القا گردید. ﳏصول بیان نیز با روش SDS-PAGE و Western-Blot بررسی شده است. - 16 -
نتیجه گﲑی و ﲝث:
تلفیق آهنا،الگوی تغیﲑات جدیدبا مطالعه نتایج ﲢقیقات قبلی و در hG-CSF به این صورت تعیﲔ گردید: تبدیل ترئونﲔ 1 به آلانﲔ، لوسﲔ 3 به ترئونﲔ، گلیسﲔ 4 به تﲑوزین، پرولﲔ 5 به آرژنﲔ، سیستئﲔ 17و گلیسﲔ 28 ، 149 و 150 به آلانﲔ. با توجه به ساختمان سوم hG-CSF به نظر می رسد که این آمینواسیدها در ارتباط مستقیم باهم نبوده و لذا احتمال اثرات آنتاگونیستی تغیﲑات آهنا نسبت به هم ضعیف است. ﳘچنﲔهیچ کدام از این آمینواسیدها در سایت اتصال به رسپتور قرار ندارند. 14 - ،8، - 3برای تغیﲑات جهش زایی با استفاده از PCRدر دو مرحله جداگانه ناحیه 5’ ژن -N - ترمینال پروتئﲔ - و ناحیه3’ ژن -C - ترمینال پروتئﲔ - ،طی شش واکنش اﳒام شد، به طوری که ﳏصول هر واکنش اول به عنوان الگو برای واکنش بعدی عمل می کند. پس از آنقطعه DNA حاصله در وکتور پلاﲰیدی pBlue script کلون شده و با تأیید تغیﲑات اعمال شده با توالی یابی ﳏصول، در وکتور بیانی pET21a ﲢت کنﱰل پروموتر T7 lac کلون شده و به باکﱰی - E.coli BL21 - DE3 منتقل گردید.
سویه حاوی وکتور نوترکیب در ﳏیط LB broth حاوی آمپی سیلﲔ با غلظت 50 mg/ml در انکوباتور ﳘزن دار در دمای 37°C کشت داده شده و بیان پروتئﲔ با استفاده از IPTG القا گردید. در زمان های ﳐتلف سلول های باکﱰی ﲨع آوری و با بافر اختصاصی لیز شده و با روش SDS-PAGE میزان پروتئﲔ مورد نظر با وزن تقریبی 20 کیلودالتون بررسی شد به طوری که چهار ساعت پس از القاء بیشﱰین مﲑان بیان با تولید %30 پروتئﲔ تام سلول حاصل گردید. - شکل - 1 ﳘچنﲔ Western- Blotting با استفاده از آنتی بادی منوکلونال ضد hG-CSF اﳒام گردید. - شکل - 2این hG-CSF نوترکیب پس از ﲣلیص، در ادامه کار مورد آنالیزهای مربوطه جهت سنجش میزان فعالیت بیولوژیکی، پایداری و زمان ماندگاری آن در مقایسه با hG-CSF طبیعی قرار خواهد گرفت.
