بخشی از مقاله
چکیده
از مهمترین دستاوردهای بیوتکنولوژی در صنعت غذا، توسعه سویههای میکروبی جدید و استفاده از تکنیک recombinant deoxyribonucleic - rDNA - acid به منظور تولید آنزیمهای صنعتی می باشد. امروزه از بین 4000 آنزیم شناخته شده در حدود 200 نوع آن در صنایع مختلف کاربرد دارند کهاکثراً از منابع میکروبی به وسیله فرمانتاسیون مواد با پایه زیستی حاصل شدهاند. آنزیمهای هیدرولیتیکی مانند پروتئازها، آمیلازها، آمیدازها، استرازها و لیپازها بخش عمده ای از داد و ستد آنزیم های صنعتی - حداقل - %75 را در بر می گیرند. از مهمترین محاسن آنزیم های نوترکیب، افزایش راندمان تولید آنزیم ، تنوع آنزیم های تولید شده، بهبود خصوصیات آنزیم نظیر افزایش مقاومت حرارتی و تولید آنزیم های با خلوص بالاتر نسبت به روشهای شیمیایی میباشد. آنزیمهای صنعتی بعد از تکمیل فرایند ایزولاسیون، بازیافت و خالصسازی معمولاً همراه با رقیق کننده مناسب، نگهدارنده و پایدارکننده به بازار عرضه میگردد.
البته تولید آنزیم صنعتی با خلوص %100 بسیار پرهزینه بوده وجزء مراحل حساس و پیچیده فرایند تخمیر صنعتی محسوب میگردد. در بیشتر موارد آنزیم های صنعتی همراه با ناخالصیهای ناچیز از جمله متابولیتهای تولید شده توسط میکروارگانیسم، بقایای مواد خام مصرفی در محیط تخمیر فرمانتور می باشد. از دیگر جنبههای قابلتوجه ویژه در این تکنیک ، ارزیابی سالم بودن آنزیم های صنعتی حاصل از میکروارگانیسم های دست ورزی شده میباشد که توسط Scientific Committee for Food - SCF - صورت می گیرد. این کمیته استفاده از هرگونه میکروارگانیسم صنعتی پاتوژنیک و مولد متابولیت های سمی در تکنیک rDNA غیر مجاز شناخته است و خلوص آنزیم صنعتی تولید شده را مطابق current Good Manufacturing Practice - cGMP - ارزیابی میکند. واژه های کلیدی: آنزیم نوترکیب، بیوتکنولوژی و DNA نوترکیب
مقدمه
تولید صنعتی آنزیم های حاصل از سویه های دست ورزی شده مستلزم استفاده از منابع میکروبی - سویه - سالم، رشد سویه با راندمان بالا تحت شرایط صنعتی در فرمانتور، قابلیت دست ورزی کردن سویه و تولید آنزیم های متنوع1 توسط سویه دستکاری شده میباشد. لذا از سال 1997 سازمان غذا و دارو آمریکا برنامه های منسجم و قانونمندی را برای انتخاب سویه های صنعتی به منظور تولید آنزیم در صنعت غذا مطرح نموده است. درخواست مجوز برای تولید آنزیم صنعتی نوترکیب می بایست شامل مشخصات آنزیم و سویه مولد آن، روشهای تهیه آنزیم مورد نظر - ترکیب کامل محیط کشت، وسایل بکاررفته برای تولید و شرایط تخمیر از جمله هوادهی، همزدن، دما و - pH، ترکیب آنزیم تهیه شده - از لحاظ میزان ناخالصیهایی نظیر فلزات سنگین، حلالها و سایرمواد شیمیایی باقی مانده از فرایند تولید - و داده های سم شناسی درباره آنزیم یا سویه میکروبی مربوطه - عدم بیماریزا بودن میکروارگانیسم و عدم تولید آنتی بیوتیک، مایکوتوکسین و سایر سموم شیمیایی توسط میکروارگانیسم - باشد. در جدول 1 لیست مهمترین آنزیم های صنعتی شده در فرایند مواد غذایی به همراه منابع سویه های میکروبی دست ورزی شده مطرح شده است. گسترده ترین مصارف آنزیمهای میکروبی در صنعت غذا در تولید شیرینکنندهها و پنیرسازی است.
سویههای باکتریایی مطرح شده در جدول 1 همگی سالم و غیرپاتوژنیک بوده ولی عدم سمیت بعضی از سویه های قارچی مثل Aspergillus niger، Aspergillus oryza و Fusarium venenatum هنوز به اثبات نرسیده است و ممکن است تحت شرایط کشت مولد متابولیت های ثانویه سمی باشد ولی چون مقدار متابولیت ثانویه تولید شده بسیار ناچیز بوده و کمتر از مقدار قابل شناسایی می باشد و تاکنون بر سلامتی انسان و حیوان تاثیری نداشته است توسط سازمان غذا و دارو آمریکا سالم گزارش شده است. از مهمترین سویه های میکروبی برای بیان ژن های کدکننده آنزیم های صنعتی می توان Ecoli k-12 برای تولید کیموزین، Pseudomonas Biovar I Xuorescens در تولید - آمیلاز و Fusarium venenatum در تولید زایلاناز را ذکر نمود. سویه های میکروبی وحشیمعمولاً مولد آنزیمهای پروتئازی خارج سلولی هستند که در فرایند تولید آنزیمهای صنعتی مشکل ساز بوده و باعث تجزیه شدن آنزیم های صنعتی ناهمگن میگردد، لذا برای حل این معضل از سویههای موتانت - جهش یافته - که ژن تولید پروتئاز خارج سلولی آنها غیر فعال شده است، استفاده میشود.
انتخاب و توسعه سویه میکروبی صنعتی مولد آنزیم جستجوی میکروارگانیسم مناسب برای تولید صنعتی آنزیمی خاص شامل روشهای غنی سازی سویههای مطلوب و سنجش تقریبی میزان تولید آنزیم است. یک سویه صنعتی خوب مقدار زیادی آنزیم با تراکم بالا تولید می کند در حالیکه میکروارگانیسم نوع وحشی، آنزیم مطلوب را در مقادیر کمتر از نیاز تجاری تولید میکند. یک مانع اصلی تولید آنزیم به میزان زیاد پدیده مهار کاتابولیکی است،که در آن منابع کربن آسان هیدرولیز شونده نظیر گلوکز، بیوسنتزبسیاری از آنزیم های تجزیه کننده را مهار میکنند. مهار کاتابولیکی را میتوان با دستکاری محیط یا تغییر ژنتیکی میکروارگانیسم به حداقل رساند. به عنوان مثال با انتخاب میکروارگانیسمهای جهش یافته مقاوم به آنالوگهای غیرمتابولیزه شونده گلوکز، جداسازی سویههای مقاوم نسبت به مهار کاتابولیکی کربن را امکانپذیر مینماید. مشکل دیگر این است که بطور معمول ، آنزیم های تجزیه کننده تنها به هنگامی به مقدار زیاد سنتز می شوند که القا کننده اختصاصی در محیط وجود داشته باشد.
در بسیاری از این موارد، مکانیسم تنظیمی منفی نقش دارد که در غیاب القاکننده پروتئین مهارکننده از بیان ژن های ساختاری آنزیم های تجزیه کننده جلوگیری می کند. در این حالت تشکیل کمپلکسی بین القاکننده و مهارکننده ژنهای ساختاری تولید آنزیم را از توقف رها میکند. در تولید آنزیم های برون سلولی به فراورده های ژنی بیشتری نسبت به آنزیم های درون سلولی نیاز است و این نکته را در تولید تجاری سویه های مولد آنزیم باید در نظر گرفت. پلی پپتیدهای پیش ساز آنزیم های برون سلولی، در درون سلول یا در محل هایی بر روی غشای سلول ساخته شده و آنگاه در محیط ترشح می شوند. این مراحل با تغییرات بعد از ترجمه نظیر تبدیل پروتئولیتیک پیش ساز پلی پپتیدی به پلی پپتید کامل و همچنین گلیکوزیلدار شدن در قارچها همراه است.
مطابق جدول 1اخیراً برای تولید چندین آنزیم مهم صنعتی به منظور فرایند مواد غذایی - -آمیلاز و پروتئاز - ، پروتئین های دارویی، آنتی بیوتیک ها و نوکلئوتیدهای تشدید کننده طعم مواد غذایی از سویه های دست ورزی شده باکتری گرم مثبت و اسپورزا باسیلوس سوبتلیس استفاده میشود. Bacillus subtilis 168 سویهای است که از مابین سویه های وحشی انتخاب شده و توالی کامل ژنوم آن بررسی شده و مشخص شد فاقد هر گونه ژن پاتوژنیک و ژن مولد سم - انتروتوکسین همولیتیک و غیر همولیتیک - میباشد لذا برای تولید آنزیمهای صنعتی به عنوان میزبان،کاملاً سالم شناخته شده است. اسپورزا بودن باسیلوس سوبتلیس بعضی اوقات بیان شدن ژن آنزیم های صنعتی را دچار اختلال می کند و علاوه بر این سویه هایی از باسیلوس سابتلیس مولد پروتئازهای خارج سلولی بوده که آنزیم صنعتی را تجزیه میکند، لذا به منظور رفع این معضل از سویه های موتانت فاقد پروتئاز خارج سلولی و موتانت های غیر اسپورزا در تولید آنزیم نوترکیب استفاده میشود.
کیموزین اولین آنزیم نوترکیب کنترل شده توسط دولت آمریکا میباشد و در سال 1999 سازمان غذا و دارو و انجمن میکروبیولوژیستهای آمریکا سالم بودن آنزیم کیموزین نوترکیب تولید شده توسط Ecoli k-12 را تایید نمودند. برخی از سویه های اشریشیاکلی مولد سم شبیه شیگلا میباشند. سویه هایEcoli k-12 ژن پروکیموزین گاوی را دریافت نموده و بعد از رشد و تکثیر در فرمانتور و تولید پروکیموزین، سلولهای اشریشیاکلی لیز شده و پروکیموزین به خارج سلول - داخل محلول محیط کشت - تراوش می کند بعد از خالصسازی و تیمار اسیدی پروکیموزین به کیموزین تبدیل میشود. سودوموناس فلورسنس باکتری گرم منفی که زیستگاه اصلی آن خاک، میوه ها و سبزیجات می باشد و بعضی از سویه های آن بیماریزا بوده و برای سلامت انسان و حیوان مضر می باشد. سویه وحشی سودوموناس فلورسنس MB101 که اولین بار از کاهو در مزارع کالیفرنیا ایزوله شد در سال 1989برای تولید آنزیم آلفا آمیلاز نوترکیب استفاده شد و سالم بودن آن توسط سازمان غذا و دارو آمریکا مورد تایید میباشد و از سال 1997 تاکنون، سویه سودوموناس فلورسنس Biovar I برای تولید آلفا آمیلاز نوترکیب مقاوم به حرارت استفاده می شود.
آسپرژیلوس اوریزا و آسپرژیلوس نیگرجزء قارچهای رشتهای و معروف در صنعت نانوایی، انواع آشامیدنی و تولید آنزیمهای صنعتی نوترکیب هستند. برخی از سویه های این دو قارچ صنعتی مولد مایکوتوکسین و متابولیتهای ثانویه سمی در مقدار ناچیز به خصوص تحت شرایط استرس زا و محیط تخمیر میباشند که انتخاب سویه میزبان در زمینه تولید آنزیم نوترکیب را با مشکل مواجه میکند. در صورتی که از سویههای مولد مایکوتوکسین و متابولیت ثانویه در فرایند تولید آنزیم صنعتی استفاده میشود، میبایست فرایند از لحاظ کلیه پارامترها به دقت کنترل شود تا مطمئن شویم تولید این ترکیبات تا انتهای فرایند تخمیر در کمترین مقدار خود میباشد و وجود یا عدم وجود مایکوتوکسین در آنزیم نهایی تولید شده نیز توسط آزمایشات ایمونولوژیکی رایج ارزیابی شده وسپس در مقیاس تجاری تولید و به بازار عرضه گردد.
دو سویه IFO4177 و A1560 آسپرژیلوس اوریزا بیشترین کاربرد را در زمینه تولید آنزیم نوترکیب دارد. سویه A1560 مقدار ناچیزی 3- -nitropropionic acid، kojic acid و cyclopiazonic acid و سم آفلاتوکسین تولید می کند که تولید این متابولیت ها تحت کنترل سه ژن Non functional بوده در شرایط مستعد بیان می شوند. لذا این سویه قارچی توسط عوامل جهش زا مورد عملیات مدیفیکاسیون و اصلاحات ژنتیکی قرار گرفته و از طریق تخریب سه ژن داخلی TAKA- amilase، ژن پروتئاز قلیایی و ژن متالوپروتئین خنثی، سویه موتانت مناسبی برای تولید آنزیم های نوترکیب بدست آمده است. تحقیقات انجام شده در سال 2004 نشان داد که % 3-10 از سویه های آسپرژیلوس نیگر تحت شرایط تخمیر مولد مایکوتوکسین های مضر و سرطانزا به خصوص اکراتوکسین A هستند علاوه بر این برخی سویه ها مولد متابولیت های ثانویه نظیر Nigragillin، Nigerazin B، Malformin ،Naphtho - - pyrone و اگزالیک اسید می باشند که همگی سمی میباشند. لذا تهیه سویه های موتانت از آسپرژیلوس نیگر به منظور تولید آنزیم های نوترکیب با راندمان زیاد ضروری است.
سویه DS03043 از ژن گلوکوآمیلاز هفت کپی فعال روی ژنوم خود دارد که محققین با عملیات موتاسیون توانسته اند موتانت هایی را از آن تهیه کنند که این هفت ژن از ژنوم حذف گردد وچندین کپی از آنزیم نوترکیب مورد نظر به جای آن قرار گیرد و آنزیم با راندمان زیاد توسط این میزبان تولید شود. مطابق جدول 1 سویه های موتانت آسپرژیلوس نیگر در تولید آنزیم های نوترکیب فیتاز، زایلاناز، لیپاز و کیموزین - به مقدار کم - کاربرد دارد
با استفاده از تکنیک های rDNA به منظور تولید آنزیم نوترکیب زایلاناز ،ژن این آنزیم از Thermomyces lanuginosus گرفته شد و به سویه موتانت Fusarium venenatum MLY3 منتقل شد. این سویه توسط سازمان غذا و دارو آمریکاکاملاً سالم گزارش شده است. سویهMLY3 در سال 1968 در بریتانیا از خاک ایزوله شد و کلیه آزمایشات تعیین خصوصیات مورفولوژیکی، مولکولی، تولید مایکوتوکسین و متابولیت های ثانویه روی آن انجام شد. ژن مولد متابولیت های ثانویه نظیر fusarin C - سم مقاوم به حرارت و نور - ، tricothocene، Enniatin B - پپتید حلقوی با اثر حشره کشی و ضد باکتریایی - بهصورت طبیعی روی ژنوم این سویه قارچی وحشی وجود دارد که این متابولیتها کنترل فرایند تخمیر را دچار اختلال کرده و تولید آنزیم های آلوده به سموم میکند لذا با عملیات موتاسیون، حذف ژنهای مولد این ترکیبات صورت گرفته و از سویه موتانت برای تولید آنزیم زایلاناز نوترکیب استفاده می شود.
از سال 1992 تولیدآنزیم کیموزین نوترکیب با انتقال ژن پروکیموزین گاوی به سویههای موتانت Kluyveromyces marxianus var.lactis مثل سویه 21CFR 184 .1685 تولید می شود و در محیط تخمیر با تنظیم pHاز پروکیموزین، کیموزین تولید می شود. این قارچ قبلاً با نام ساکارومایسس لاکتیس شناخته می شده است. تاریخچه قدیمی این قارچ در تبدیل لاکتوز شیر به گالاکتوز و گلوکز حاکی از سالم بودن آن بوده و از سال1984 نیز از لحاظ سمیت و پاتوژنیک بودن، سالم معرفی شد و سویه 21 CFR 184. 1388 این قارچ در تولید آنزیم لاکتاز نوترکیب کاربرد دارد. این قارچ ژن مربوط به تولید آنزیم سلولاز و همیسلولاز را بصورت طبیعی دارد و علاوه براین سویههای موتانت آن می توانند میزبان مناسبی برای تولید آنزیم صنعتی نوترکیب پکتین لیاز هم باشند. ژن آنزیم پکتین لیاز از A.niger var awamori به این میزبان مستعد منتقل می شود. این قارچ اولین بار در سال 1944 از دانههای کتان در جزایر Solomon بدست آمد و سویه های وحشی مولد متابولیتهای ثانویه نظیر مایکوتوکسین، Trichodermin، Trichothecene می باشد که سمی بوده و میبایست برای انتخاب سویه صنعتی از این قارچ ، موتانت تهیه شود. موتانت 21 CFR
