بخشی از مقاله
چکیده:
قند ترهالوز به عنوان محافظت کنندهای برون سلولی است که با آبکشی از سلول و کاهش تشکیل کریستالهای درون سلولی آسیب به غشای اسپرم را میکاهد. فرضیه این مطالعه، انجماد اسپرم در رقیق کننده هایپراسموتیک به وسیله افزودن غلظتهای مختلف ترهالوز به رقیق کننده حاوی لسیتین سویا و اثر آن روی فراسنجههای جنبایی اسپرم، یکپارچگی غشا، زندهمانی و میزان
اسپرمهای غیر طبیعی در منی منجمد- یخ گشایی شده قوچ میباشد. در این مطالعه، نمونههای منی از چهار قوچ بالغ با استفاده از مهبل مصنوعی جمع آوری شد. نمونههای منی با رقیق کننده تریس حاوی لسیتین سویا با غلظتهای مختلف ترهالوز 50 - و 100
میلی مولار - و فاقد ترهالوز - گروه شاهد - رقیق و پس از سرد سازی در پایوتهای 0/25 میلیلیتری منجمد شدند. نتایج این پژوهش نشان میدهد که غلظت 100 میلیمولار ترهالوز باعث افزایش معنیدار جنیایی کل، جنبایی پیش رونده، زندهمانی و یکپارچگی غشا اسپرم نسبت به غلظت 50 میلیمولار و گروه شاهد شده است . - p<0/05 - نتایج این پژوهش نشان دهنده آن است که افزودن ترهالوز 100 میلی مولار در رقیق کننده حاوی لسیتین سویا باعث بهبود جنبایی، یکپارچگی، زندهمانی، و کاهش میزان اسپرم غیر طبیعی شده و باعث بهبود کیفیت اسپرم منجمد شده میشود.
واژههای کلیدی: انجماد- لسیتین سویا- ترهالوز- جنبایی- قوچ
مقدمه:
انجماد اسپرم به توسعه تکنیکهای تولید مثلی نظیر، تلقیح مصنوعی و لقاح آزمایشگاهی کمک میکند. فرایند انجماد اسپرم با دیگر تکنولوژیهای تولید مثلی که برای حفظ گونههای در حال انقراض و همچنین حل مشکل ناباوری وجود دارد، مرتبط است . - 4 - اگرچه زرده تخم مرغ یکی از رایجترین نگه دارندههای برون سلولی است که باعث حفاظت از اسپرم طی فرآیند انجماد-یخگشایی میشود، ولی به دلیل بروز مشکلاتی از جمله عدم امکان استاندارد سازی و وجود احتمالی آلودگیهای میکروبی، در سالهای اخیر تلاشهایی به منظور جایگزین کردن آن با منابع دیگر از جمله منابع گیاهی صورت گرفته است . - 7 - غشای پلاسمای اسپرم یکی اجزا کلیدی در سلول میباشد و سلول را تحت فرایند انجماد زنده نگه میدارد. اگرچه رقیق کنندههای ایزو- اسموتیک به طور معمول در رقیق سازی منی قوچ استفاده می شود - 1 - ، ولی رقیق کنندههای هایپراسموتیک با غلظتهای مختلف قند در حال گسترش و این ترکیبات بیشتر به عنوان بهبود دهندههای یکپارچگی غشای اسپرم بعد از فرایند انجماد - یخگشایی شناخته میشوند. عمل محافظت کنندگی ترهالوز به این شکل است که آب داخل سلولی را برای انجماد بهتر کاهش میدهد و به دنبال آن میزان آسیب به سلول را به وسیله کاهش تشکیل کریستالهای یخ، کاهش میدهد . - 3 - هدف از این مطالعه به کار گرفتن غلظتهای مختلف ترهالوز در رقیق کننده تریس حاوی لسیتین برای کاهش میزان صدمه به اسپرم و بهبود کیفیت آن برای افزایش میزان باروری می باشد.
مواد و روشها:
نمونههای منی در فصل تولید مثلی از چهار قوچ 3 - تا 5 ساله - بالغ نژاد زندی که در ایستگاه پرورش اصلاح نژاد گوسفند زندی ورامین تحت شرایط یکسان جیره و جایگاه نگهداری میشدند به وسیله مهبل مصنوعی و دو بار در هفته به مدت 5 هفته جمعآوری شدند. نمونههافوراً بعد از جمع آوری در حمام آب گرم 33 درجه سانتیگراد تا زمان ارزیابی قرار داده شدند. پس از آن غلظت و جنبایی اسپرم، حجم و میزان اسپرم غیر طبیعی ارزیابی شد، و فقط از نمونههایی که دارای اسپرمهای با جنبایی بیش از 70 درصد، حجم بین 1 تا 2 میلی لیتر، غلظت بیش از 3×109 اسپرماتوزوآ در میلیلیتر و کمتر از 10 درصد اسپرم غیر طبیعی داشت، برای انجماد استفاده شد. برای حذف اثرات فردی قوچ، نمونههای منی با هم مخلوط شدند. بافرتریس - تریس 27/1 گرم در لیتر، سیتریک اسید 14 گرم در لیتر، فروکتوز 10 گرم در لیتر - و لسیتین سویای 1 درصد وزنی/حجمی و گلیسرول 5 درصد - حجمی/حجمی - به عنوان رقیق کننده استفاده شد. غلظتهای مختلف ترهالوز 50 - و 100 میلی مولار - به رقیق کننده فوق اضافه شد. رقیق کننده در گروه شاهد فاقد ترهالوز بود.
بعد از رقیق سازی، نمونهها در داخل پایوتهای 0/25 میلی متری کشیده شده و ظرف مدت 2 ساعت تا چهار درجه سانتی گراد سرد شده و بعد از سردسازی، برای انجماد، پایوتها در ارتفاع 5 سانتیمتری از سطح ازت مایع در معرض بخار ازت قرار داده شدند و پس از آن، در ازت مایع غوطهور شدند. به منظور ارزیابی اسپرم بعد از فرایند انجماد پایوتهای منجمد شده در حمام آب گرم 37 درجه و طی 30 ثانیه یخ گشایی شدند. ارزیابی ویژگیهای جنبایی اسپرم به وسیله کامپیوتر - CASA ,Version 12 IVOS ,USA - انجام شد. ارزیابی زندهمانی اسپرماتوزوآ در نمونهها به وسیله روش رنگآمیزی ائوزین-نگروزین انجام شد . - 6 - تست HOST برای ارزیابی یکپارچگی غشای اسپرم به کار برده شد . - 5 - برای ارزیابی اسپرمهای غیر طبیعی هم از محلول هانکوک استفاده شد . - 9 - طرح آماری به کار رفته در پژوهش طرح کاملا تصادفی بود. دادههای بدست آمده با استفاده از نرم افزار SAS با رویه GLM آنالیز و میانگینها با آزمون توکی مقایسه شد.
نتایج و بحث:
اثر افزودن غلظتهای متفاوت ترهالوز بر ویژگیهای جنبایی اسپرم در رقیق کننده منی قوچ در جدول یک آورده شده است. نتایج حاصل از این پژوهش نشان میدهد که تیمار ترهالوز 100 میلیمولار تفاوت معنیداری روی جنبایی کل و جنبایی پیش رونده اسپرم به ترتیب با مقادیر 61/71 1/88 - ، - 27/86 1/35 در مقایسه با تیمارهای ترهالوز 50 میلیمولار به ترتیب با مقادیر 52/00 1/88 - ، - 21/29 1/35 و گروه شاهد به ترتیب با مقادیر 43/00 1/88 - ، - 18/57 1/35 داشته است . - p<0/05 - مقایسه بین سطوح مختلف ترهالوز نشان داد که غلظتهای 50 و 100 میلیمولار در فراسنجههای VAP، VSL، VCL تفاوت معنیداری با هم ندارند - p>0/05 - ، ولی ترهالوز 100 میلی مولار باعث افزایش معنیدار این فراسنجهها نسبت گروه شاهد شده است . - p<0/05 - همچنین ترهالوز 100 میلی مولار باعث افزایش معنیدار زندهمانی و یکپارچگی غشای اسپرم در مقایسه با ترهالوز 50 میلی مولار و گروه شاهد شده است . - p<0/05 - هر دو سطح ترهالوز 50 - و 100 میلی مولار - باعث کاهش معنیدار
اسپرم غیر طبیعی نسبت به گروه شاهد شدهاند . - p<0/05 -
یافته های این پژوهش با نتایج بسیاری از محققین مانند آیسن و همکاران - 2002 - ، جعفراوغلی و همکاران - 2011 - ، ماتسوکا و همکاران - 2006 - در قوچ، ابوگلا و همکاران - 2003 - ، نینگ و همکاران - 2010 - در بز، مطابقت داشت. تفاوت عمده این آزمایش با آزمایشات دیگر جایگزینی زرده تخم مرغ با لسیتین سویای 1 درصد میباشد. نتایج تحقیقات انجام شده نشان میدهد که محافظت کنندههای برون سلولی مانند ترهالوز به دلیل داشتن وزن مولکولی بالا، قادر به عبور از غشای اسپرم نبوده و نقش برون سلولی ایفا میکنند و با ایجاد فشار اسمزی، باعث آبکشی از سلول اسپرم، پیش از فرایند انجماد میشوند و از تشکیل کریستالهای یخ درون سلولی جلوگیری و یا میزان تشکیل این کریستالها را کاهش میدهند 8 - ،2،. - 1
نتایج تحقیقات انجام شده نشان میدهد که در طول انجماد، ترهالوز با فسفولیپیدهای غشای پلاسمایی واکنش میدهد و موجب حفاظت از غشا، افزایش سیالیت و کاهش تشکیل کریستالهای یخ میشود و در نتیجه باعث تثبیت و حفظ سلامتی غشای اسپرم در طی انجماد میشود . - 1 - در مطالعهای که شرفی و همکاران - 2009 - ، فروزان فر و همکاران - 2010 - ، روی انجماد اسپرم با جایگزینی زردهی تخم مرغ با لسیتین سویا انجام دادهاند گزارش کردهاند که لسیتین سویا 1 درصد میتواند جایگزین زردهی تخم مرغ در رقیق کنندهی منی قوچ شود 10 - ،. - 7 نتایج بدست آمده از این آزمایش نشان میدهد کها فزودن غلظتهای مختلف ترهالوز در رقیق کننده حاوی لسیتین سویا باعث بهبود کیفیت اسپرم شده، در نتیجه میتوان از این رقیق کننده برای بهبود کیفیت اسپرم منجمد شده بهره برد.
