بخشی از مقاله
چکیده:
هدف از تحقیق حاضر، مطالعه اثر اضافه کردن اسید چرب امگا- - 3 منبع - DHA در چهار سطح صفر، 0/1 ، 1 و 10 نانو گرم در میلی لیتر و ویتامینE در سه سطح صفر، 0/1 و 0/2 میلی مولار به صورت جداگانه در محیط رقیق کننده بایوکسل بر قابلیت انجماد و ترکیب اسیدهای چرب اسپرم قوچ زندی بود. در این آزمایش اسپرم گیری از ده رأس قوچ بالغ نژاد زندی ایرانی با استفاده از مهبل مصنوعی در دو مرحله انجام گرفت. خصوصیات کیفی اسپرم شامل درصد جنبائی، تحرک پیشرونده، زنده مانی، اسپرم های زنده و مرده و میزان بازیافت سلول اسپرم بعد از انجماد در 10 پایت - تکرار - در دماهای 37درجه سانتی گراد و پس از ذوب تعیین شد. گروه دریافت کننده 0/1 نانو گرم در میلی لیتر اسید چرب امگا-3 بعد از انجماد پائین ترین میانگین را از نظر درصد تحرک پیشرونده 51/02. 0/11 - در برابر 51/95 0/11، 0/11 51/89 و 52/01 0,11 به ترتیب برای 0,1، 0، 1 و 10 نانو گرم در میلی لیتر - و درصد اسپرم های زنده و مرده رونده 0/11 - 3/31 در برابر 0/11 3/54، 3/41 0/11 و 3/6 0/11 به ترتیب برای 0/1، 0، 1 و 10 نانو گرم در میلی لیتر - در مقایسه با سایر گروهها داشت 0/05 - . - 3 ولی میانگین جنبائی، زنده مانی و میزان بازیافت سلول اسپرم بعد از انجماد در بین چهار سطح تفاوت معنی داری نداشت. گروه دریافت کننده صفر میلی مولار ویتامینE بعد از انجماد بالاترین میانگین را از نظر درصد جنبائی - 50/02 0/13 - ، تحرک پیش رونده - 44/3 0/13 - ، زنده مانی - 59/80 0/13 - در مقایسه با سایر گروهها داشت . - 3 0.01 - نتایج نشان داد که تغییر در سطح اسید چرب مصرفی در محیط رقیق کننده در قوچ زندی تأثیری در بهبود خصوصیات کمی و کیفی سلول اسپرم بعد از انجماد ندارد و نمیتواند باعث بهبود قابلیت انجماد شود.همچنین اضافه کردن ویتامین E به تنهایی در محیط رقیق کننده در قوچ زندی باعث کاهش خصوصیات کمی و کیفی سلول اسپرم بعد از انجماد می شود و نمیتواند باعث بهبود قابلیت انجماد شود.
کلمات کلیدی: اسید چرب امگا،-3 ویتامین -E رقیق کننده بایوکسل- قابلیت انجماد اسپرم- قوچ زندی مقدمه:
یکی از فناوریهای مهم جهت حفظ و نگهداری ذخایر ژنتیکی، انجماد اسپرم است. اسپرمهای منجمد شده جهت تلقیح مصنوعی بایستی از کیفیت لازم جهت تلقیح مصنوعی برخوردار باشند. بنابراین فرایند انجماد اسپرم فناوری دقیق و ماهرانهای است که طی چند دهه اخیربرای بهبود آن فعالیت های عمدهای صورت گرفته است، اما کماکان میزان بازیافت اسپرم پس از انجماد رضایت بخش نبوده و بایستی بهبود یابد. دامنه انجمادپذیری در بین گونههای مختلف حیوانی و حتی بین حیوانات داخل یک گونه نیز متفاوت میباشد. مهمترین مزیت فرآیند انجماد جلوگیری از کاهش توان زندهمانی اسپرمها در طی یک دوره زمانی طولانی مدت باشد. اهمیت فرآیند انجماد اسپرم به عنوان فرایندی که مانع از آسیب رساندن به سلول اسپرم و همچنین کاهش تنشهای ناشی از تغییرات سلولی میباشد، واضح است. اسپرم در منی رقیق نشده، برای زمان کوتاهی زنده میماند وسرد کردن آهسته منی تا دمای 5 درجه سانتیگراد سبب مرگ بسیاری از اسپرمها میشود. بنابراین، مایع رقیق کننده، فزون بر این که باید برای رقیق کردن مناسب باشد، لازم است که اسپرمها را در خلال سرد شدن حفظ کند و دوره زندهمانی آنها را افزایش دهد. در بیشتر گونههای پستانداران از جمله نشخوارکنندگان بخش اعظم اسیدهای چرب غشای اسپرم، اسیدهای چرب بلند زنجیر غیراشباع است که بیشتر شامل سریهای n-3 است. اسید دوکوزاهگزاانوئیک - DHA ، - C22:6 n-3، اسید چرب غالب فسفولیپیدهای غشای اسپرم است، به
طوری که بالغ بر 60 درصد از کل اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه را تشکیل میدهد . - 2 - به طور کلی در ترکیب اسیدهای چرب پرندگان اهلی، وجود مقدار زیادی اسیدهای چرب n-6 به اثبات رسیده است، در حالی که در پستانداران اهلی مقدار زیادی اسیدهای چرب غیر اشباع n-3 وجود دارد. شواهد نشان دهنده این مطلب است که کاهش در مقدار اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه - PUFA - باعث کاهش در تعداد، تحرک و قابلیت انجماد اسپرمها در بسیاری از گونههای اهلی پستانداران میشود . - 3 - پرزپی3و همکاران 2001 و زرون4 و همکاران 2002 گزارش کردند که وجود مقادیر کافی اسید لینولئیک در جیره، مانع از پدیده شوک سرمایی شده و قابلیت زنده ماندن اسپرماتوزویید را بالا میبرد. بهبود سیالیت غشاء باعث پاسخدهی بهتر اسپرم به گونادوتروپینها میشود 5 - ، . - 7 در مطالعهای که توسط بدر5 و همکاران در سال 2004 انجام گرفت، افزودن اسیدهای چرب و اضافه کردن کلسترول بر محیط رقیق کننده انجمادپذیری و قدرت باروری اسپرم قوچ در شرایط برون تنی را بهبود بخشید . - 1 - اضافه کردن ویتامین E به عنوان یک آنتی اکسیدان باعث حفاظت از غشای سلول اسپرم در برابر اکسیداسیون میشود. با توجه به آن که در طی رقیق سازی منی برای انجماد، غلظت ویتامین Eبه عنوان مهمترین آنتی اکسیدان حیاتی سلول به شدت کاسته میشود، بنابراین اضافه کردن آنتی اکسیدانها از جمله ویتامین E برای محافظت از غشای سلولهای اسپرم و جلوگیری از تشکیل پراکسیدهای اکسیژن ضروری به نظر میرسد 4 - ، . - 6 با توجه به مطالب بیان شده، هدف از این پژوهش، مطالعه اثر افزودن سطوح مختلف منبع اسیدهای چرب n-3 به رقیق کننده تجاری بایوکسل بر قابلیت انجماد اسپرم قوچ زندی بود.
مواد و روش ها:
رقیق کننده مورد استفاده در این آزمایش بایوکسل - imv,France - 6 یک نوع رقیقکننده تجاری عاری از زرده تخم مرغ بود.
کپسولهای ژلاتینی خوراکی روغن ماهی حاوی 1000 میلیگرم روغن ماهی - امگا- - 3 مخصوص مصارف انسانی به عنوان منبع اسیدهای چرب n-3 مورد استفاده قرار گرفتند. ویتامین Eمورد استفاده در این آزمایش، آلفاتوکوفرول کاملاً خالص C29H50O2 - ، - حاوی تقریباً 600 واحد بینالمللی - IU - در هر گرم و ساخت شرکت سیگما - Sigma, USA - بود. در این
آزمایش از 10 رأس قوچ نژاد زندی ایرانی با میانگین سن 3 سال استفاده شد. اسپرمگیری از حیوانات به طور معمول هر هفته طی دو روز و در دو نوبت انجام میشد. نمونهها به سرعت به داخل حمام بن ماری با دمای 37 درجه سانتیگراد منتقل شدند و درصد تحرک اسپرم در منی خام تعیین گردید. نمونه های دارای درصد تحرک بیش از 65 درصد برای مراحل بعدی آزمایش استفاده و با هم مخلوط شدند 10 - قوچ در دو انزال20 = نمونه - . سپس 0/5 میلیلیتر از نمونه منی به هر کدام از لولههای آزمایشی حاوی 0/5 میلیلیتر از گروه تیمارهای مورد نظر - 0، 0/1، 1 و 10 نانوگرم در میلی لیتر اسید چرب - و ویتامین E اختصاص داده شدند
- نسبت - 1:1 و خصوصیات کیفی اسپرم از قبیل درصد اسپرمهای جنبا، درصد اسپرمهای با تحرک پیشرونده، درصد اسپرمهای مرده و زنده، درصد زنده مانی و میزان بازیافت سلول اسپرم پس از انجماد در دمای 37 درجه سانتی گراد، تعیین شد. از هر کدام از نمونه های آزمایشی حدود 20 پایت تهیه شده - پایتهای 0/5 میلی لیتر - و نمونههای هر تیمار به مدت 3 تا 4 ساعت در یخچال با دمای 5 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. فرایند انجماد سازی با استفاده از دستگاههای نیمه خودکار IMV انجام شد.
پایتها به مدت 10 دقیقه به فاصله 5/5 سانتیمتر برروی بخار ازت قرار داده شدند و سپس به داخل ازت مایع با دمای -196 درجه سانتی گراد وارد شدند. 24 ساعت پس از انجماد، پایتهای منجمد در آب 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 تا60 ثانیه قرار گرفته و محتوای آنها روی لام تخلیه شد. خصوصیات کیفی اسپرم مطابق با مرحله پیش از انجماد تعیین شد - درصد اسپرمهای جنبا، درصد اسپرمهای با تحرک پیشرونده، درصد اسپرمهای مرده و زنده درصد زنده مانی و درصد میزان بازیافت سلول اسپرم پس از انجماد - . داده های حاصل به کمک رویه GLM نرم افزار SAS مورد تحلیل آماری قرار گرفت و میانگینها در سطح 0/05 معنی دار تشخیص داده شدند.
نتایج و بحث:
بین سطوح مختلف اسیدهای چرب امگا-3، گروه دریافت کننده 0/1 نانوگرم در میلیلیتر دارای تفاوت معنیدار - P<0/05 - و پایین ترین میانگین را از نظر درصد تحرک پیشرونده 51/02 0/11 - در برابر 51/95 0/11، 51/89 0/11و 0/11 52/01به ترتیب برای 0,1، 0، 1 و 10 نانو گرم در میلی لیتر - و درصد اسپرم های زنده و مرده رونده 3,31 0,11 - در برابر 3,54 0,11، 3,41 0,11 و 3,60 0,11 به ترتیب برای 0,1 ، 0، 1 و 10 نانو گرم در میلی لیتر - در مقایسه با سایر گروهها داشت. ولی میانگین جنبائی، زنده مانی و میزان بازیافت سلول اسپرم بعد از انجماد در بین چهار سطح تفاوت معنی داری نداشت. جدول . - 1 - بین سطوح مختلف ویتامین E، سطح صفر mM، دارای تفاوت معنیدار - جنبائی: 50/02 0/13، تحرک پیش رونده:
44/30 0/45، زندهمانی: - P<0/05 - - 59/80 0/45 و بالاترین میانگین را از لحاظ خصوصیات کیفی منی پس از انجماد در مقایسه با سطوح 0/1mM - جنبائی: 40/00 0/13، تحرک پیش رونده: 35/02 0/13، زندهمانی: - 48/90 0/45 و 0/2mM - جنبائی: 42/50 0/13، تحرک پیش رونده: 37/30 0/13، زنده مانی: - 51/50 0/13 دارا بود.این آزمایش نشان داد که بین سطوح مختلف اسیدهای چرب امگا-3 از لحاظ توانائی حفظ کیفیت اسپرم در طی مراحل انجماد در بعضی از پارامترهای کیفی اسپرم اختلاف معنی داری وجود دارد. با توجه به نتایج این آزمایش و سایر پژوهشهای انجام گرفته در این زمینه، میتوان چنین نتیجه گرفت که استفاده از اسیدهای چرب در محیط رقیق کننده نمی تواند به تنهایی انجماد پذیری اسپرم را بهبود بخشیده و سطوح پایین تر آن، توانائی کمتری در این رابطه دارد - به خصوص برای درصد تحرک پیش رونده و درصد اسپرم های زنده و مرده - .
این آزمایش نشان داد که بین سطوح مختلف ویتامین E از لحاظ توانائی حفظ کیفیت اسپرم در طی مراحل انجماد اختلاف وجود دارد و اضافه کردن ویتامین E به تنهایی در محیط رقیق کننده باعث کاهش خصوصیات کیفی منی پس از انجماد می شود. علت احتمالی این امر آن است که رقیق کننده تجاری بایوکسل به احتمال قوی حاوی مقادیر کافی از آنتی اکسیدان های لازم است. در ضمن این امکان وجود دارد که افزودن ویتامین E در مقادیر مورد استفاده در آزمایش حاضر برای رقیق کننده بایوکسل مناسب
