بخشی از مقاله
چکیده اسپرم با استفاده از واژن مصنوعی از 4 راس قوچ تالشی بالغ جمع آوری شد. اسپرم استخراجی به وسیله 2 رقیقکننده سیترات سدیم و تریس مکملسازی شده با زرده تخممرغ جهت ذخیرهسازی رقیق شد. سپس اسپرم رقیقشده به ترتیب در دو دمای 5 و20 درجه سانتیگراد نگهداری شد. غلظت و pH اسپرم در هر یک از نمونهها برآورد شد. میزان زندهمانی اسپرم 2، 4 و6 ساعت بعد از اسپرمگیری مورد اندازهگیری قرار گرفت. جهت تعیین زندهمانی اسپرم، از دو روش رنگآمیزی با ائوزین-نگروزین و آزمون تورم هیپواسموتیک استفاده گردید و میزان تحرک اسپرم به وسیله مشاهده با میکروسکوپ اختلاف فاز تعیین شد. تمامی عوامل کیفی اسپرم تحت تأثیر نوع رقیقکننده، دمای نگهداری و زمان قرار گرفت - . - P<0/05 اسپرم ذخیره شده در رقیقکننده تریس در طی زمان 6 ساعت و در دماهای متفاوت خصوصیات کیفی بهتری از جمله تحرک، زندهمانی و سلامت غشاء را نشان داد . - P< 0/05 - نتایج آزمایش نشان داد که ذخیرهسازی اسپرم قوچ تالشی در دمای 5 درجه سانتیگراد در مقایسه با ذخیرهسازی در دمای 20 درجه سانتیگراد سبب شد تا تغییرات صورت گرفته در کیفیت اسپرم کاهش یابد . - P<0/05 - نتایج نشان داد که استفاده از رقیقکننده تریس جهت رقیقسازی اسپرم قوچ در مقایسه با رقیقکننده سیترات سدیم در طی مدت ذخیره سازی 6 ساعته در دو دمای 5 و 20 درجه موجب حفظ بالاتر خصوصیات کیفی اسپرم شد . - P<0/05 - تفاوتهای مشخص شده بین رقیقکنندههای مختلف که نمود خود را در نتایج حاصل از تلقیح مصنوعی نشان میدهد، نیاز به مطالعه بیشتری دارد.
واژگان کلیدی: سیترات سدیم- تریس- تحرک اسپرم- زندهمانی اسپرم - قوچ تالشی
مقدمه
تلقیح مصنوعی، استفاده موثر از اسپرم مازاد جنس نر را ممکن میسازد . - 1 - مراحل تلقیح مصنوعی شامل اسپرمگیری، ارزیابی نمونه، ذخیرهسازی و تلقیح است. استفاده از روش مناسب و دقت در انجام هر یک از مراحل، نقش بسزایی در موفقیت تلقیح مصنوعی دارد . - 8 - ذخیرهسازی منی مهمترین مرحله در تلقیح مصنوعی است . - 9 - با توجه به فاصله زمانی بین اسپرمگیری و تلقیح، داشتن یک محیط مناسب برای ذخیرهسازی اسپرمها با استفاده از رقیقکنندهها امکان پذیر میشود . - 14 - هر یک از روشهای جدیدی که جهت فرآوری اسپرم مورد استفاده در تلقیح مصنوعی استفاده میشود باید قبل از استفاده گسترده در شرایط مزرعهای، در آزمایشگاه مورد ارزیابی دقیق قرار گیرند که بدین منظور از روشهای تعیین کیفیت آزمایشگاهی اسپرم استفاده می-شود و تمرکز این روشها روی برآورد عوامل کیفی اسپرم مانند زندهمانی، میزان تحرک و سلامت غشاء سیتوپلاسمی است . - 10 - نتایج تحقیقات مختلف نشان داده است که که نوع رقیقکننده مورد استفاده در فرآیند رقیقسازی و شرایط نگهداری اسپرم - دما و زمان - روی کیفیت اسپرم تاثیر زیادی دارد اما در این زمینه بین گونههای مختلف حیوانی تفاوتهایی وجود دارد که میتواند ناشی از تفاوتهای فیزیولوژی و نیازهای متابولیکی متفاوت اسپرم گونههای مختلف باشد. از این رو مطالعه این تاثیرات در گونههای مختلف از اهمیت بالایی برخوردار است . - 12 - با توجه به مشکل موجود در تلقیح مصنوعی میشهای تالشی که بین اسپرمگیری و تلقیح مصنوعی یک فاصله زمانی رخ داده و با این عمل کارآیی تلقیح مصنوعی پایین بود این تحقیق انجام شد. لذا هدف از این تحقیق ارزیابی خصوصیات کیفی اسپرم قوچ تالشی در شرایط استفاده از رقیقکنندههای سیترات سدیم و تریس و ذخیرهسازی در
دماهای مختلف جهت حفظ کیفیت آن تا زمان تلقیح مصنوعی بود.
مواد و روشها در فصل تولید مثل چهار قوچ نژاد تالشی با میانگین سنی 1/5 سال و میانگین وزنی 45/5 4 کیلوگرم انتخاب و با استفاده از روش واژن مصنوعی اسپرمگیری صورت گرفت. منی بلافاصله به آزمایشگاه انتقال داده شد و تعیین غلظت اسپرم، رقیقسازی و سرد کردن صورت گرفت. غلظت اسپرم انزالی از تمامی قوچها قبل از رقیقسازی با استفاده از لام هموسیتومتر اندازهگیری شد و میزان رقیقسازی بر حسب مقادیر اندازه گیری شده تعیین گردید. pH نمونه های اسپرم با استفاده از pH متر الکترونیک اندازه-گیری شد. برای رسیدن به غلظت مناسب برای دیگر آزمایشات، اسپرم استخراجی با استفاده از رقیقکنندههای تریس مکملسازی شده با گلیسرول و زرده تخم مرغ، سیترات سدیم رقیقسازی شد.
گروههای آزمایشی عبارت بودند از: گروه اول اسپرم رقیق شده با رقیقکننده سیترات سدیم و ذخیره سازی در دمای 5 درجه سانتیگراد، گروه دوم اسپرم رقیقشده با رقیقکننده سیترات سدیم و ذخیره سازی در دمای 20 درجه سانتیگراد ، گروه سوم اسپرم رقیقشده با رقیقکننده تریس و ذخیره سازی در دمای 5 درجه سانتیگراد ، گروه چهارم اسپرم رقیقشده با رقیقکننده تریس و ذخیره سازی در دمای 20 درجه سانتیگراد. این تحقیق به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با 4 تیمار و4 تکرار انجام پذیرفت. فاکتورها عبارت بودند از: 2 نوع رقیق کننده - تریس و سیترات سدیم - و 2 سطح دما 5 - و 20 درجه سانتیگراد - . متغیرهایی که اندازهگیری شد شامل میزان تحرک، زندهمانی و سلامت غشاء سیتوپلاسمی بود که در ساعتهای 2، 4 و 6 پس از اسپرمگیری اندازهگیری شدند. جهت تجزیه دادههای طرح از نرم افزار SAS با استفاده ازبرنامه proc ANOVA و جهت مقایسه میانگینها از آزمون چند دامنهای دانکن با سطح معنی دار 5 درصد استفاده شد.
نتایج و بحث
نتایج مربوط به pH ، غلظت و حجم اسپرم دارای اختلاف معنیدار نبودند . - P>0/05 - نتایج مطالعات نشان میدهد که روش اسپرمگیری، فصل و تفاوتهای انفرادی بر خصوصیات کیفی اسپرم میتواند موثر باشد . - 4 - طی آزمایشات متعدد در گوسفند غلظت اولیه اسپرم روی تغییرات صورت گرفته در خصوصیات کیفی اسپرم طی مدت ذخیرهسازی موثر است . - 3 - نتایج این تحقیق نشان داد که تاثیر شرایط نگهداری - دما و زمان - و نوع رقیقکننده مورد استفاده روی خصوصیات تحرک، زندهمانی و سلامت غشاء سیتوپلاسمی اسپرم معنیدار بود . - P<0/05 - بطوریکه بیشترین درصد تحرک و زندهمانی اسپرم مربوط به گروه سوم ، 2 ساعت بعد از اسپرمگیری و کمترین میزان تحرک و زندهمانی اسپرم مربوط به گروهدوم ، 6 ساعت بعد از اسپرمگیری بود - جدول . - 1 نتایج مطالعات روی اسپرم قوچ و بز کوهی نشان داد که کلیه خصوصیات کیفی اسپرم شامل تحرک، قدرت باروری، زندهمانی، فعالیت متابولیکی اسپرم شامل مصرف O2 و تولید CO2 و همچنین تبادلات غشاء اسپرم و میزان تعادل یونی اسپرم و میزان مصرف ATP و تولید مواد دفعی توسط اسپرم تحت تاثیر نوع رقیقکننده و شرایط ذخیرهسازی قرار گرفت . - 11 - همچنین نتایج تحقیقات نوع رقیقکننده مورد استفاده و شرایط ذخیرهسازی اسپرم شامل دما و زمان را روی خصوصیات کیفی اسپرم موثر دانستند و دلیل این امر را تفاوتهای فیزیکی و شیمیایی رقیقکنندههای مختلف اعلام نمودند . - 7 -
جدول-1 تاثیر شرایط ذخیره سازی اسپرم روی خصوصیات کیفی اسپرم در گروههای آزمایشی
گروه اول: رقیق شده با رقیق کننده سیترات سدیم و نگهداری در دمای 5 درجه سانتیگراد، گروه دوم: رقیق شده با رقیق کننده سیترات سدیم و نگهداری در دمای 20 درجه سانتیگراد، گروه سوم: رقیق شده با رقیق کننده تریس و نگهداری در دمای 5 درجه سانتیگراد، گروه چهارم: رقیق شده با رقیق کننده تریس و نگهداری در دمای 20 درجه سانتیگراد.
اثر نوع رقیقکننده روی خصوصیات تحرک، زندهمانی و سلامت غشاء سیتوپلاسمی اسپرم نشان دهنده تاثیر نوع رقیقکننده بر خصوصیات تحرک، زندهمانی و سلامت غشاء سیتوپلاسمی است. جهت حفظ خصوصیات کیفی اسپرم رقیقکننده تریس در اولویت اول و سیترات سدیم در مرتبه دوم قرار داشت. تاثیر نوع رقیقکننده بر توانایی تحرک اسپرم میتواند بوسیله حفظ pH محیط با کمک رقیقکننده مورد استفاده و واکنشهای شیمیایی مواد موجود در رقیقکننده با اجزاء غشاء سیتوپلاسمی اسپرم طی مدت ذخیره سازی صورت گیرد. محققین با مطالعه روی اسپرم قوچ همبستگی نزدیک بین pH محیط و توانایی تحرک اسپرم را بیان کردند و pH مناسب جهت محیط نگهداری اسپرم قوچ را 7-7/5 عنوان نمودند . - 11 - به نظر میرسد تاثیر رقیقکننده بر زندهمانی اسپرم ناشی از تاثیر روی فعالیت دینامیکی غشاء است . - 13 - همچنین دلیل تفاوت رقیقکنندههای مختلف در حفظ زنده-مانی اسپرم را میتوان به تفاوت قند موجود در آنها و میزان اسمولاریته محیط نگهداری بیان کرد . - 15 - محققین تاثیر رقیقکننده بر سلامت غشاء سیتوپلاسمی اسپرم را به علت اثر آن بر میزان نفوذ پذیری غشاء ناشی از تفاوتهای ساختاری و شیمیایی رقیق-کنندههای مختلف دانستند . - 2 - غلظت آدنوزین تری فسفات در محیط نگهداری اسپرم عامل مهمی در حفظ کیفیت اسپرم است و از سوی دیگر غلظت ATP و اسمولاریته محیط نگهداری تاثیر عمدهای روی میزان نفوذ پذیری غشاء اسپرم دارد که عامل اصلی در کنترل سلامت غشاء و زندهمانی اسپرم است . - 6 - تحقیقات نشان داده است که یونهای معدنی موجود در رقیقکننده با اتصال به قسمتهای آبدوست گلیکوپروتئینهای غشاء اسپرم موجب حفظ خصوصیات این گلیکوپروتئینها و باعث جلوگیری از پارگی و اختلال در نفوذ پذیری غشاء اسپرم میشود . - 5 - سلامت غشاء سیتوپلاسمی اسپرم عاملی حیاتی جهت زندهمانی اسپرم است.
