مقاله روشهای ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی در شرایط طبیعی و آزمایشگاهی

بخشی از مقاله

چکیده:

در این مقاله، مروری بر مطالعات انجام شده در ارتباط با روش های ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی صورت گرفته است . این روشها به دو دستهی بررسی در شرایط طبیعی - in vivo - و بررسی تحت شرایط آزمایشگاهی - in vitro - طبقه بندی می شوند. نتایج حاکی از آن است که در بین انواع روشهای قابل استفاده، روش DPPH، به طور گسترده برای تخمین فعالیت آنتی اکسیدانی در شرایط آزمایشگاهی - in vitro - و روش LPO، به طور وسیعی برای تخمین خاصیت آنتی اکسیدانی در شرایط طبیعی - in vivo - مورد استفاده قرار گرفته اند. حلال مورد استفاده برای استخراج آنتی اکسیدانها از منابع طبیعی از اهمیت زیادی برخوردارند در این بین اتانول یکی از پرکاربرد ترین حلالهای مورد استفاده بوده است.

کلید واژه ها: فعالیت آنتی اکسیدانی، آنتی اکسیدانهای طبیعی، DPPH، .LPO

مقدمه:

بدن انسان دارای یک سیستم پیچیده دفاعی طبیعی آنزیمی و آنتی اکسیدانی غیرآنزیمی است که با اثرات مضر رادیکال های آزاد و دیگر اکسیدان ها مقابله می کند. رادیکال های آزاد، مسئول ایجاد بسیاری از بیماری ها از جمله سرطان - Kinnula and Crapo, 2004 - ، بیماری های قلبی عروقی - Singh and Jialal , 2006 - ، اختلالات عصبی - Sas et al . 2007 - ، بیماری آلزایمر - Smith et al., 2000 - ، بیماری پارکینسون - Bolton et al ,2000 - ، پیری - Hyun et al ,2006 - میباشند.

می توان با مصرف کافی آنتی اکسیدان های رژیم غذایی، حفاظت در برابر رادیکال های آزاد را افزایش داد . روشهای مختلفی برای تحقیق بر روی نمونه های آنتی اکسیدان ها - رژیم غذایی، عصاره های گیاهی، آنتی اکسیدانهای تجاری و غیره - استفاده می شود. هدف از این مقاله مروری، بررسی برخی از این روشها است.

روشهای ارزیابی قدرت آنتی اکسیدانی:

الف - بررسی تحت شرایط آزمایشگاهی : - in vitro -

روش :DPPH - DPPH مولکول 1و- 1 دی فنیل -2-1پیکریل هیدرازیل - یک رادیکال آزاد پایدار ، دارای رنگ بنفش عمیقی با حداکثر شدت جذب در 517 نانومتر می باشد. با جذب این مولکول توسط مواد دارای قدرت آنتی اکسیدانی، شدت جذب آن در این طول موج کاهش مییابد. در این روش، عصاره متانولی نمونه - 0/2ml - با محلول - 0/5mM - DPPH ترکیب شده و شدت جذب آنها در طول موج 517 نانومتر در زمان صفر - A1 - و 30 دقیقه بعد از ترکیب - A2 - ، ثبت شده و با استفاده از فرمول زیر، درصد مهار رادیکال DPPH محاسبه می شود . - Manzocco et al., 1998 - = [ - A1 - A2 - / A1 ] × 100 درصد مهار رادیکال DPPH

روش مهار هیدروژن پراکساید : - H2O2 - 1

از ورق مختلف نظیر مصرف محصولات گیاهی، استنشاق بخار یا غبار، از طریق چشم و یا تماس با پوست، روزانه حدود H2O2 0/ 28mg جذب بدن انسان می شود این ترکیبسریعاً به اکسیژن و آب تجزیه می شود و نیز ممکن است رادیکالهای هیدروکسیل - OH° - را تولید کند این رادیکالها می تواند آغاز پراکسیداسیون چربی بوده و موجب آسیب به DNA در بدن میشوند.

براساس روش Ruch و همکاران - 1989 - برای سنجش قدرت یک آنتی اکسیدان بر اساس قدرت جذب H2O2، یک محلول هیدروژن پراکسید - 40 mM - در بافر فسفات 50 mM - ، - 7/4pH آماده شده و شدت جذب آن در طول موج 230nm سنجیده میشود - A1 - سپس عصاره آبی نمونه - 20-60g/ml - به آن اضافه شده و پس از 10دقیقه مجدداً شدت جذب - A2 - مشخص شده و سپس از طریق فرمول زیر قدرت آنتی اکسیدانی نمونه مورد نظر بر اساس درصد مهار هیدروژن پراکساید گزارش میشود = [ - A1 - A2 - / A1 ] × 100 درصد مهار H2O2

فعالیت مهار کنندگی نیتریک اکساید:

ترکیب سدیم نیتروپروساید در محیط آبی در pH فیزیولوژیکی - 7/2 - ، تجزیه شده و تولید رادیکال NO° میکند این ماده در حضور هوا با اکسیژن ترکیب شده و محصولات پایداری نظیر نیترات و نیتریت به وجود میآورد میتوان با استفاده از معرف گریس مقدار آنها را تعیین کرد - Marcocco et al,1994 - در این روش 2 mlاز سدیم نیتروپروساید10 mM در 0/5 ml بافر فسفات سالین - 7/4pH - حل شده با 0/5ml از غلظت های مختلف نمونه - 0/2-0/8mg/ml - مخلوط می شود.

سپس مخلوط به مدت 150 دقیقه در دمای 25 °c انکوباتورگذاری میشود سپس، 0/5ml از این محلول با 0/5ml معرف گریس مخلوط شده و پس از30 دقیقه نگهداری در دمای اتاق، شدت جذب آن در طول موج 546nm اندازه گیری می شود. قدرت مهار کنندگی رادیکال نیتریک اسید با استفاده از فرمول زیر محاسبه می شود در اینجا A0 مقدار جذب قبل از واکنش است و A1 مقدار جذب بعد از واکنش است: = [ - A0 – A1 - / A0 ] × 100 درصد مهار رادیکال NO°

روش :ABTS

ABTS°+ یک رادیکال کاتیون پایدار با حداکثر قدرت جذب در طول موج 750nm است. برای سنجش قدرت آنتی اکسیدانی یک ماده میتوان قابلیت آن را در مهار این رادیکال سنجید. در این روش برای تولید ABTS°+، دی اکسید منگنز - 80mg - به 5 میلی مولار محلول ABTS آبدار 20ml - استفاده شده یک 75 میلی مولار Na/K بافر با - 7 pH آماده می شوند. -6 - Trolox هیدروکسی 2 –، 5، 7، -8 تترا متیل کرومان- -2 کربوکسیلیک اسید - یک آنالوگ محلول در آب مثل ویتامین E است که می تواند به عنوان یک آنتی اکسیدان استاندارد استفاده شود.

یک منحنی کالیبراسیون استاندارد برای Trolox در غلظت های صفر، 50، 100،150،200،250،300،350 میکرو مولار ساخته شد. نمونه ها به طور مناسبی براساس فعالیت آنتی اکسیدانی در بافر Na/K با 7 pH  رقیق می شوند. نمونه های رقیق شده با 200l از محلول کاتیون رادیکال ABTS°+ و جذب - در طول موج - 750nm بعد از 5 دقیقه در یک میکروپلیت ق رائت کننده خوانده می شود. مقادیر TEAC می تواند از منحنی استاندارد Trolox محاسبه شود و به عنوان معادلات Trolox - در میلی مولار - بیان شود - Seeram et al., 2006 -

روش TRAP1

این روش بر پایه حفاظت ارائه شده توسط آنتی اکسیدان ها بر روی فروپاشی فلوئورسنس R-phycoerythrin - R-PE - در خلال یک واکنش پراکسیدانی کنترل شده است. به گفته Ghiselli و همکاران - - 1995، 120l از نمونه رقیق شده به 2/4ml بافرفسفات - 7/4 pH - ، 375l آب دو بار تقطیر شده، R-PE 30l رقیق شده و 2 ABAP 75l اضافه می شود . سینتیک واکنش در دمای 38 °c به مدت 45 دقیقه توسط یک اسپکتروفوتومتر لومینسانس ثبت شده است. مقدار TRAP از طریق طول فاز تاخیری با توجه به نمونه مقایسه شده با استاندارد محاسبه می شود.

سنجش کاهش قدرت آنتی اکسیدانی آهن - FRAP -

این روش توانایی آنتی اکسیدان ها را برای کاهش آهن - فریک - اندازه گیری می کند. اساس این روش بر پایهی کاهش کمپلکس آهن - فریک - و TPTZ 3 برای شکل فروس در pH کم است . این کاهش از طریق اندازه گیری تغییر در میزان جذب در طول موج 593nm محاسبه میشود .

بر اساس این روش 3ml از معرف FRAP آماده شده با l100 نمونه ی رقیق شده مخلوط شده و پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای 37°c میزان جذب در طول موج 593nm محاسبه میشود مقادیر FRAP را می توان از طریق مقایسه تغییر جذب در مخلوط آزمایش با آنهایی که از افزایش غلظت Fe3+ به دست آمده اند بدست آورد و به عنوان میلی مولار Fe2+ معادل هر کیلوگرم - مواد غذایی جامد - یا هر لیتر - نوشیدنی ها - از نمونه بیان شوند. - Benzie and Strain 1999 -

فعالیت مهار رادیکال سوپراکسید - SOD -

اگر چه آنیون سوپراکسید یک اکسیدان ضعیف است اما در نهایت رادیکالهای هیدروکسیل قوی و خطرناک و نیز اکسیژن یگانه تولید می کند که هر دو آنها در فساد اکسیداتیو مشارکت دارند . - Meyer and Isaksen, 1995 -   فعالیت مهار آنیون سوپراکسید را می توان همانطور که Robak و Gryglewski شرح دادند - 1988 -     اندازه گیری کرد.

رادیکال های آنیون سوپراکسید در 3ml بافر 16mM - Tris-Hcl، - 8 pH تولید می شوند، شامل 0/5ml نیتروبلو تترازولیوم - 0/3mM - - NBT - ، 0/5ml محلول - 0/936mM - NADH، 1ml عصاره و 0/5ml بافر 16mM - Tris-Hcl، - 8 pH است. این واکنش با اضافه کردن 0/5ml محلول فنازین متوسولفات - 0/12mM - - PMS - به مخلوط آغاز می شود، به مدت 5 دقیقه در دمای 25°c انکوباتورگذاری می شود و سپس میزان جذب در طول موج 560 nm در برابر یک نمونه شاهد اندازه گیری می شود.

فعالیت مهار رادیکال هیدروکسیل

رادیکال هیدروکسیل یکی از گونه های فعال اکسیژن در سیستم بیولوژیکی است که با اسیدهای چرب چندغیر اشباع موجود در نیمهی فسفولیپیدهای غشای سلولی واکنش می دهد و باعث آسیب سلولی می شود. توانایی مهار رادیکال های هیدروکسیل توسط روش Kunchandy و Rao در سال 1990 اندازه گیری شد بر این اساس، مخلوط واکنش - 1ml - تشکیل شده از 100l از 28mM - 2-deoxy- Dribos در 20 mM بافرKH2PO4-KOH ، - 7/4 pH ، 500l از عصاره، - 1/04 mM - EDTA 200 l و - 1:1 v/v - Fecl3 200 M، 100 l از - 1 mM - H2O2 و 100 l اسید آسکوربیک - 1 mM - که در دمای 37°c به مدت یک ساعت انکوباتورگذاری می شود.

1 ml تیوباربیتوریک اسید - %1 - و 1 ml تری کلرواستیک اسید - %2/8 - اضافه شده و در دمای 100°c به مدت 20 دقیقه انکوباتورگذاری می شود. بعد از سرد شدن، جذب در طول موج 532 nm در مقابل یک نمونه شاهد اندازه گیری می شود.

روش کاهش قدرت - RP -

این روش براساس اصل افزایش در جذب مخلوط های واکنش پایه گذاری شده است. افزایش در جذب، افزایش در فعالیت آنتی اکسیدانی را نشان می دهد . در این روش، ترکیبات آنتی اکسیدانی یک مجموعه رنگی با پتاسیم فریسیانید، تری کلرو استیک اسید و فریک کلرید را شکل میدهند که در طول موج 700nm اندازهگیری میشود. افزایش در جذب مخلوط واکنش، قدرت کاهش نمونه ها را نشان می دهد . - Jayaprakash et al,2001 -

در روشی که توسط Oyaizu در سال 1986 شرح داده شده است، 2/5ml از بافر فسفات - 6/6 pH - 0/2M و 2/5ml از - %1w/v - K3 Fe - CN - 6 به 1ml از نمونه حل شده در آب مقطر اضافه می شوند. مخلوط حاصل در دمای 50°c به مدت 20 دقیقه انکوباتورگذاری می شود، و سپس 2/5ml تری کلرواستیک اسید - - %10w/v به آن اضافه می شود.

مخلوط در 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتزیفیوژ می شود سپس 2/5ml از لایه فوقانی با 2/5ml آب مقطر و 0/5ml از - % 0/1 w/v - Fecl3 مخلوط شده و شدت جذب آن در . سپس در برابر نمونه شاهد در طول موج 700nm اندازه گیری می شود.