بخشی از مقاله
چکیده تحقیقات:
در زمینه بیوسنتز پروتئین ها، خصوصاً آنزیم ها بدلیل مزایاي ویژه آنها و نیز جایگزینی بیوکاتالیست هاي شیمیایی در چند دهه اخیر پیشرفت چشمگیري داشته و همچنان رو به افزایش است. پس از سنتز آنزیم ها توسط میکروارگانیسم ها، فرایند برداشت آنها از محیط و خالص سازي تحت عنوان فرایند پایین دستی، از اهمیت ویژه اي برخوردار است.
براي دستیابی به اهداف مورد نظر فرایند پایین دستی، گاه انجام مراحل مختلف و روش هاي گوناگون مورد نیاز است . اما از آنجایی که از نظر اقتصادي فرایند پایین دستی پرهزینه ترین بخش بیوسنتز این ترکیبات محسوب می شود، انتخاب روش مناسب و استفاده از مراحل کمتر و نیز دستیابی به خلوص و غلظت آنزیمی بالاتر، حائز اهمیت است. در این تحقیق عوامل و شرایط تاثیر گذار در انتخاب روش ها و تعداد مراحل، بهینه سازي و سایر پارامترهاي مرتبط با فرایند پایین دستی مورد بررسی قرار خواهد گرفت.
واژه هاي کلیدي: آنزیم، پایین دستی، کشت جامد، کروماتوگرافی تمایلی، آنزیم نوترکیب
مقدمه
تولید پروتئینها و آنزیمها در دهه هاي اخیر اهمیت چشمگیري پیدا کرده. آنزیمها کاتالیزگرهاي فرایندهاي زیستی هستند و نسبت به کاتالیزگرهاي غیر زیستی کارایی بسیار بالایی دارند. اغلب آنزیمها ساختار پروتئینی دارند، به غیر از انواع محدودي از آنها که از جنس ریبونوکلئیک اسید هستند. حدود 2500 آنزیم تا کنون کشف شده است.
آنزیم هاي فعال زیستی از هر ارگانیسم زنده قابل استخراج هستند. روشهاي سنتی تولید بیومولکول-هایی مانند آنزیمها نیاز به یکسري مجموعه عملیات واحد دارد. به طور کل یک مسیر سنتزي که توسط بیوکاتالیستها کنترل میشود، شامل 3 مرحله اصلی است. مراحل بالادستی، واکنش و مراحل پایین دستی.
مراحل بالادستی شامل طراحی محیط کشت، استریل کردن محیط کشت و کلیه تجهیزات، اپتیمایز کردن شرایط کشت، توسعه مایه تلقیح. مراحل پایین دستی شامل تخریب سلول در صورت نیاز، جداسازي فاز مایع و جامد و خالص سازيهاي نهایی است. میتوان گفت که روشهاي پایین دستی یا Downstream پرهزینه ترین بخش کل فرایند تولید آنزیم یا پروتئین است.
حتی ممکن است تا 80 درصد کل فرایند تولید آنزیم مربوط به بخش استخراج باشد. بنابراین شگفت آور نیست که تحقیقات روي این بخش از فرایند در سالهاي اخیر افزایش یافته باشد. این که بتوان در تعداد مراحل کمتري محصول را بازیابی کرد از اهمیت بسزایی برخوردار است. زیرا علاوه بر افزایش بازده کل فرایند نیز ساده تر خواهد شد.
استراتژي تخلیص آنزیم ها یا پروتئین ها
روش تخلیص 3 فازي١ یکی از مهمترین استراتژي هاي کاربردي در زمینه فرایند خالص سازي است. طبق این روش، فرایند تخلیض پروتئین ها شامل 3 مرحله اصلی است.
مرحله اول: Capture
مرحله دوم: Intermediate Purification
مرحله سوم: Polishing
هر کدام از این مراحل نیز اهداف خاصی را مد نظر دارند.
در مرحله اول یعنی Capture، هدف جداسازي، تغلیظ و تثبیت محصول یا ماده مورد نظر است . در این حالت سرعت و ظرفیت کار مورد نظر است. محصول در این مرحله تغلیظ شده و به محیطی که فعالیت آن حفظ می شود منتقل خواهد شد. ممکن است در این مرحله از کروماتوگرافی تعویض یونی و کروماتوگرافی تمایلی استفاده شود.
ظرفیت اتصال پروتئین ها به ستون مهمترین عامل در بهینه سازي فرایند تخلیص و کاهش مراحل آن است. مهمترین تکنیک در مرحله اول، کروماتوگرافی تعویض یونی است که داراي ظرفیت اتصالی بالایی است. سه نوع از کروماتوگرافی توانایی این را دارند که ماده ناخالص حاصل از تخمیر و یا ماده خام حاوي محصول مورد نظر را به صورت مستقیم به آنها تزریق کرد.
- کروماتوگرافی تمایلی، کروماتوگرافی تعویض یونی و کروماتوگرافی برهمکنش هاي آبگریز - . مواد موجود در ستون این کروماتوگرافی ها با محصول هدف پیوند داده و آن را از سایر ناخالصی ها جدا می کنند. پس می توان در مرحله اول تخلیص از آنها استفاده نمود. سرعت جریان در مرحله اول 200 تا 500 ساتی متر در ساعت است.
در طی مرحله دوم یا مرحله Intermediate ، هدف، حذف غالب ناخالصی ها مانند پروتئین هاي دیگر، اسیدهاي نوکلئیک، اندوتوکسین ها و ویروس هاست.
در این مرحله، سرعت از اهمیت کمتري نسبت به توانایی جداسازي و ظرفیت کار برخوردار است. سه نوع کروماتوگرافی نامبرده شده در بالا براي این مرحله ایده آل تلقی می شوند خصوصاً زمانی که تخلیص در مقیاس بزرگتري مورد نیاز باشد. سرعت جریان در این مرحله کمتر از مرحله اول و در حد 150 سانتی متر در ساعت است.
در مرحله آخر، هدف دستیابی به بالاترین خلوص با از بین بردن ناخالصی هاي بجا مانده و حذف موادي که از نظر ساختمانی به محصول مورد نظر شباهت دارند. در این مرحله تمرکز فقط روي به دست آوردن حداکثر خلوص است. در مراحل قبلی همه ناخالصی ها حذف شدند به جز مقدار جزئی از اسیدهاي نوکلئیک، ویروس ها و غیره. رسیدن به این درجه خلوص تنها با استفاده از تکنیک هاي با انتخاب پذیري بالا امکان پذیر نمی شود بلکه نیاز به یک بستر با کارایی بسیار بالا و داراي اندازه ذرات ریز و یکنواخت است.
تا اینجا از روش هاي جداسازي با بار، تمایلی و هیدروفوبی استفاده شد و حالا استفاده از Gel Filteration با قدرت تفکیک بالا ایده آل به نظر می رسد. فیلتراسیون ژلی آهسته ترین روش در بین تکنیک هاي کروماتوگرافی است و اندازه ستون، حجم نمونه اي را که به آن تزریق می شود، تعیین می کند. بنابراین منطقی است که در مرحله آخر که حجم نمونه کاهش یافتهاز این نوع کروماتوگرافی استفاده کرد.
سوپردکس از ستون هاي فیلتراسیون ژلی است که هم در مقیاس آزمایشگاهی و هم در مقیاس وسیع تر کاربرد دارد. سرعت جریان در این ستون 75 سانتی متر در ساعت است. سایز ذرات 13 میکرومتر بود. اما می توان از کروماتوگرافی تعویض یونی هم براي رسیدن به حداکثر خلوص در مرحله آخر استفاده کرد. در این حالت سرعت جریان 150 تا 600 سانتی متر در ساعت و اندازه ذرات 10 میکرومتر بود.
البته تقسیم بندي فرایند خالص سازي به 3 مرحله ذکر شده، به این معنی نیست که روش هاي تخلیص پروتئین ها باید 3 مرحله اي باشند. به طور مثال ممکن است مرحله اول و دوم فرایند در یک مرحله خلاصه شوند و یا در مقابل میتوان دو مرحله آخر را در یک مرحله به انجام رسانید. از مزایاي روش 3 فازي می توان سرعت عمل بالاتر، مدت زمان کوتاه تر و داشتن صرفه اقتصادي بیشتر را نام برد.
-3 عوامل تاثیر گذار در فرایند پایین دستی از عوامل تاثیر گذار در فرایند پایین دستی می توان خصوصیات خود آنزیم تولیدي، نوع سیستم کشت میکروارگانیسم تولید کننده، محل ترشح آنزیم و طبیعی یا نوترکیب بودن آنزیم تولیدي را نام برد. یکی از مهمترین عوامل در انتخاب تکنیک و دستگاه هاي فرایند پایین دستی، استفاده از خصوصیات خود پروتئین تولیدي است. در جدول 1 این موضوع بخوبی قابل مشاهده است.
جدول-1 خصوصیات تاثیر کذار پروتئین بر انتخاب روش پایین دستی محل ترشح آنزیم آنزیم هایی که توسط میکروارگانیسم تولید می شوند در محل هاي متفاوتی می مانند. برخی آنزیم ها درون سلولی بوده، برخی ترشحی بوده و برخی حتی در فضاي پري پلاسمیک باقی می مانند. بسته به محل آنزیم، روش استخراج و فرایند پایین دستی متفاوت میشود.
آنزیم تولید شده در مورد تاثیر خود آنزیم باید گفت که آنزیم هایی حالت ترشحی می گیرند که داراي سیگنال ترشحی باشند . یعنی داراي توالی اسید آمینه خاصی در یک انتها باشند که این توالی قادر به شناسایی توسط پذیرنده پروتئینی موجود در غشاي سلول است. با شناسایی این توالی توسط پذیرنده، آنزیم تولید شده می تواند از سلول خارج شود. البته شرایط محیطی که میکروارگانیسم در آن رشد می کند نیز تاثیر مهمی در تولید آنزیم خواهد داشت. مهمترین تاثیر مربوط به عامل pH می باشد.
