بخشی از مقاله
چکیده
ن از اهیمت زیادي برخوردار است. در این پژوهش از فناوري خاموشسازي ژن به روش القایی توسط ویروس - - Silencing Gene براي خاموشسازي ژن نشانگر فیتوئن دساچوراز - pds - در گیاه شاهبیزك استفاده شد. هدف، این گزارش اولین گزارش درباره خاموش سازي ژن با روش VIGS در شاهبیزك میباشد و میتواند ابزار مفیدي براي بررسی عملکرد ژنهاي هدف براي مهندسی متابولیسم در این گیاه باشد. مواد و روش ها، بدین منظور از وکتور pTRV2 حامل اگزوژن pds از گیاه توتون - NtpTRV2 - و وکتور کمکیpTRV1 استفاده شد. اگروباکترهاي حاوي وکتورها به برگهاي گیاهچه شاهبیزك در مرحله دو برگی تزریق شد. در پایان پروتئین تام در برگهاي تیمار یافته اندازهگیري شد و مقادیر رنگیزههاي کلروفیل کارتنوئید نیز اندازه گیري شد.
نتایج، بعد از حدود سه هفته سفیدشدگینوري - Photobleaching - مشاهده شد. نتایج نشان داد که ژن فیتوئن دساچوراز شاهبیزك با موففیت خاموش شده است که نتیجه آن کاهش در میزان رنگیزههاي گیاهی بود. محتواي کلروفیل a، b، کلروفیل تام و کارتنوئیدها در تیمار NtpTRV2 نسبت به گیاهچههاي شاهد به ترتیب و به طور متوسط 10/9 ، 7/4 ، 9/3 و 11/27 برابر کاهش یافت. مقایسه محتواي پروتئین تام نیز در تیمار NtpTRV2 در مقایسه با شاهد 2/04 برابر کمتر بود.
واژههاي کلیدي: القاي خاموشی ژن بواسطه ویروس، فیتوئن دسچوراز، سفید شدگینوري، شاهبیزك
مقدمه
گیاه شاهبیزك - Atropa belladonna - از تیره سیبزمینی - solanaceae - از مشهورترین گیاهان دارویی و حاوي تروپان آلکالوئیدها شامل هیوسیامین و اسکوپولامین میباشد . - 1 - علیرغم اهمیت زیاد مسیر بیوسنتزي این مواد، عملکرد دقیق بسیاري از ژنهاي این مسیر هنوز ناشناخته است. یکی از روشهاي شناسایی فعالیت ژنها خاموش کردن ژن و مشاهده فنوتیپ حاصل از خاموشسازي میباشد. VIGS یک تکنیک خاموشسازي بسیار سریع 3 - تا 4 هفته از عفونت تا خاموشی - و ارزان می باشد . - 2 - این تکنولوژي از مکانیسم دفاعی ضد ویروس در گیاهان به عنوان ابزاري براي ژنتیک معکوس بهره میبرد. براي بررسی امکان انجام این روش در یک گیاه، در ابتدا از یک ژن نشانگر مانند فیتوئن دساچوراز استفاده میشود که در صورت خاموشسازي، فنوتیپی مشخص و قابل مشاهده - سفید شدگی نوري برگ - را بروز میدهد. ژن pds آنزیم فیتوئن دسچوراز را کد می کند،
فیتوئن دسچوراز غیراشباع سازي پیوند کربن 12-11 فیتوئن و پیوند کربن 12-11 فیتوفلوئن را کاتالیز نموده و از این رو یکی از آنزیمهاي مهم در مسیر ساخت کاروتنوئیدها بحساب میآید . - 3 - کارتنوئیدها رنگیزه هاي ایزوپرنیلی لازم براي محافظت ساختارهاي فتوسنتزي در همه گیاهان سبز می باشند . - 4 - در صورت خاموش شدن ژن pds میزان کارتنوئیدها در گیاه کاهش یافته و درنتیجه کلروفیلها تجزیه میشوند و در برگها سفیدشدگی نوري مشاهده میشود. در این پژوهش براي نخستین بار از ژن فیتوئن دساچوراز گیاه توتون - Nicotiana benthamiana - براي خاموشسازي ژن هومولوگ آن در شاهبیزك استفاده شده است. نتایج این پژوهش میتواند در خاموشسازي سایر ژنهاي مهم شاهبیزك - از جمله ژنهاي دخیل در بیوسنتز آلکالوئیدها - بکار گرفته شود.
مواد و روش ها:
وکتورهاي pTRV2 حامل اگزوژن - pds با طول 697 جفت باز - از گیاه Nicotiana benthamiana به همراه وکتور خالی pTRV2 و وکتور کمکی pTRV1 به باکتري E.coli انتقال یافته و تکثیر شد. وکتورهاي مورد نظر استخراج گردیده و سپس با استفاده از PCR مورد تایید قرار گرفت. در مرحله بعد وکتورهاي حاوي ژن توتون - NtpTRV2 - و فاقد آن - pTRV2 - بهمراه وکتور کمکی - pTRV1 - به اگروباکتریوم تومفاسینس - - GV3101 انتقال یافت و پس از تایید نهایی با تکنیک غربالگري PCR، در نهایت با روش Velasquez و همکاران - 5 - به برگهاي گیاهچه 25 روزه شاهبیزك تزریق شد. به طور خلاصه در این روش براي تولید گیاهچههاي 25 روزه، بذرهاي گیاه شاهبیزك در دماي 23 درجه سانتیگراد درون پیت مخصوص - Tref Peat Moss - در گلدان کشت داده شد. سپس اگروباکتریوم حاوي وکتورهاي pTRV2 حامل اگزوژن توتون - NtpTRV2 - و وکتور خالی - pTRV2 - با باکتريهاي حاوي وکتور pTRV1 مخلوط و با یک سرنگ بدون سوزن به برگ گیاهچه 25روزه - در مرحله دوبرگی - تزریق شد. بعد از حدود 3 هفته، گیاهچه ها برداشت شده و استخراج و سنجش مقدار پروتئین تام از برگها به روش - Bradford 1976 - صورت گرفت. همچنین استخراج و سنجش رنگیزههاي فتوسنتزي شامل کلروفیلها و کاروتنوئید به روش اسپکتروفتومتري و بر اساس روش Arnone - 1949 - انجام شد. نتایج بدست آمده به وسیله نرم افزار آماري GraphPad - version 5.03 - آنالیز شد.
نتایج و بحث:
آنالیز حضور وکتورهاي اصلی و نوترکیب در کلونهاي آگروباکترویوم نشان داد که این باکتريها حاوي وکتورهاي مورد نظر هستند - شکل . - 1 بعد از حدود 3 هفته از تزریق وکتورها، سفیدشدگی درون گیاهچههاي شاهبیزك آلوده با وکتور حامل اگزوژن توتون مشاهده شد. نتایج نشان داد که خاموش سازي با استفاده از ژن توتون باعث ایجاد سفیدشدگی ناکامل در برگ شاهبیزك شد که احتمالاً نتیجه خاموشسازي نسبی ژن فیتوئن دساچوراز در گیاه شاهبیزك به وسیله اگزوژن برگرفته از گیاه توتون بوده است - شکل . - 2 بررسیها نشان داد که محتواي کلروفیل، کارتنوئید و پروتئین تام در نمونههاي خاموشسازي شده نسبت به نمونههاي شاهد کاهش معنیداري - p≤0.05 - یافت، اما از این نظر در تیمار pTRV2 تغییر معنیداري نسبت به نمونههاي شاهد مشاهده نشد. نتایج نشان داد محتواي کلروفیلهاي a، b و کلروفیل کل و کارتنوئیدها در تیمار NtpTRV2 نسبت به گیاهچههاي شاهد به ترتیب 10/9 ، 7/4 ، 9/3 و 11/27 برابر کاهش یافته است - شکل . - 3 مقایسه محتواي پروتئین تام نشان داد که این مقدار نیز در تیمار NtpTRV2 در مقایسه با نمونه شاهد 2/04 برابر کاهش یافته است - شکل . - 4
سفیدشدگی نوري در برگ هاي شاهبیزك تزریق شده با ناقلین اصلی
سفیدشدگی نوري حاصل، به دلیل کاهش کارتنوئیدها و پیرو آن تجزیه کلروفیلها - به علت نقش حفاظت کاروتنوئیدها از کلروفیل ها - بوده که این نتایج با مطالعات قبلی صورت گرفته روي گیاهان مدل مانند توتون همخوانی داشت - 8 - قبلاً. از اینروش براي بررسی عملکرد ژنهاي مسیر بیوسنتز متابولیتهاي ثانویه در بذرالبنج - Hyoscyamus niger - استفاده شده بود که مسیر آن بسیار شبیه مسیر موجود در شاهبیزك میباشد . - 9 - در کل نتایج این پژوهش نشان داد که با استفاده از تکنیک VIGS میتوان نسبت به
