بخشی از مقاله
چکیده
38 ژنوتیپ امیدبخش بادام با استفاده از روش PCR در سال 1393 مورد بررسی قرار گرفت. براي بررسیهاي مولکولی استخراج DNA به روش دلاپورتا - تغییریافته - انجام شد. سپس کلیهي ژنوتیپها با آغازگرهاي عمومی - AS1II/AmyC5R - و آغازگرهاي اختصاصی - CEBASf/AmyC5R - که مشخص کنندهي ژنوتیپ هاي سازگار و یا الل Sf بهصورت اختصاصی بود، تکثیر شدند.
در نهایت عکسبرداري از ژل آگارز بعد از اتمام الکتروفورز با نور ماوراء بنفش انجام گردید. نتایج بررسیهاي مولکولی مشخص کرد که از میان ژنوتیپهاي دیرگل، ژنوتیپ K26 علاوه بر دیر گل بودن داراي صفت خودگشنی نیز بود که این مورد در آنالیز مولکولی با تشکیل باندي بهاندازه 499 bp مشخص شد. همچنین بررسیهاي مولکولی نیز نشان داد که فراوانی اللهاي Sf و S1 در 38 ژنوتیپ مورد بررسی به ترتیب 34/21 و 81/58 درصد بود.
مقدمه
بادام با نام علمی Prunus amygdalus Batch syn. Prunus dulicis Mill/D.A.Webb، یکی از مهمترین میوه هاي خشک مناطق معتدله در دنیا به شمار می رود که به دلیل سهولت در برداشت، نگهداري و حمل نقل، سازگار بودن با خاك هاي آهکی و مناطق نیمه خشک از ارزش اقتصادي بالایی برخوردار می باشد. یکی از مشکلات تولید بادام خود ناسازگاري است که موجب کاهش شدید تشکیل میوه و درنهایت ایجاد مشکل در مدیریت باغ می گردد. بنابراین اصلاح بادام به منظور ایجاد ارقام خود سازگار اهمیت بالایی دارد
به عبارت دیگر گرده افشانی و باروري گل هاي اکثر ارقام بادام به دلیل سیستم ناسازگاري گامتوفتیک - - SI نیازمند گرده ارقام سازگار است که در سطح کلاله پذیرا قرار گیرد. گرده افشانی ناقص یکی از مهمترین دلایل کاهش عملکرد و عدم دستیابی به پتانسیل تولید در بادام است
از آنجا که تعیین ارقام خودسازگار بادام و کشت آنها در زمان احداث باغ، کارایی کشت بادامو عملکرد را به طور چشمگیري افزایش می دهد بنابراین اهمیت دارد که ارقام خود گشن و روش اصلاح سریع آنها در برنامه هاي اصلاحی مورد توجه قرار گیرد
به همین دلیل، تحقیقات وسیعی در جهان در جهت شناسایی و دستیابی به ارقام مناسب خود گشن بادام در حال اجرا میباشد
براي این کار استفاده از روشهاي جدید مبتنی بر PCR در بررسی خودناسازگاري و خودسازگاري درختان بادام از موفقیت زیادي برخوردار بوده است. از روش PCR براي شناسایی اللهاي خودناسازگاري و خودسازگاري در بادام استفاده شده است
آغازگرهاي اختصاصی و عمومی مختلف بر اساس توالی مکان ژنی ناسازگاري در بادام و دیگر گونههاي جنس Prunus طراحیشده است که بهطورموفقیت آمیزي باعث تکثیر اللهاي خودناسازگار در رقمهاي بادام میشود
این روش با توجه به دقت زیاد و سهولت کاربرد، یک روش آسان، کم هزینه، دقیق و قابل اطمینان بوده و از آنجایی که گلدهی لازم نمی باشد در سن نونهالی نیز قابل اجرا بوده و در مقایسه با روش آنالیز ریبونولکئازهاي خامه دست یابی به ژنوتیپ هاي خود سازگار،زودترامکان پذیر است
از طرفی کارآمد بودن این روش در اصلاح درختان میوه از جمله بادام به علت هزینه بالا و وقت گیر بودن فرآیند اصلاح داراي اهمیت زیادي است. در این پژوهش خودناسازگار و خودسازگاربودن ژنوتیپ بادام با استفاده ازروش PCR تعیین شده است
مواد و روشها
برگها مواد گیاهی این تحقیق شامل حداقل 38 ژنوتیپ حاصل گرده افشانی آزاد بادام رقم تونو بود. در ابتدا از هر ژنوتیپ نمونه هاي برگی تهیه و تا زمان استخراج DNA در دماي-80 نگهداري شدند. در این پژوهش از روش لوپز و همکاران - Lopez et - al.,2006 جهت استخراج DNA استفاده شد. لازم به ذکر است که استخراج DNA در گیاه بادام به دلیل دارا بودن متابولیتهاي ثانویه مانند پلی فنلها و ترکیبات پلی ساکاریدي فراوان، اندکی مشکل است، ترکیبات بافري مورد استفاده در این روش در جدول 1 آمده است.
جدول1 ترکیبات اجزا بافر مورد استفاده براي استخراج DNA
پس از استخراج DNA، تعیین کمیت و کیفیت DNA با استفاده از روش اسپکتو فتو متري انجام شد. این روش بر مبناي طیف جذب DNA می باشد. پس از این که دستگاه کالیبره شد، 980 میکرولیتر از آب مقطر و 20 میکرولیتر از DNA نمونه را در کووت ریخته و اعداد مربوط به طول موج هاي 260 نانومتر - طول موج جذب نور توسط اسیدهاي نوکلئیک - و 280 نانومتر - طول موج جذب نور توسط پروتئین ها - خوانده شد و نسبت جذب نوري 260/280 و غلظت نمونه DNA یادداشت شد. نسبت جذب نوري260/280 به منظور تعیین کیفیت DNA به کار میرود که باید بین 1/7 تا 2 باشد. پس از تعیین غلظت نمونه هاي DNA، براي واکنش زنجیره اي پلی مراز، غلظت نمونه به مقدار 10 نانو گرم در میکرو لیتر رقیق شد.
براي انجام PCR پس از استخراج DNA ژنومیک - هسته و کلروپلاست - اقدام به تکثیر آن در مخلوط PCR گردید. این مخلوط شامل 7/5 میکرو مولار از Master Mix آماده، ساخت شرکت سیناژن - با غلظت - 2X موجود بود که شامل تمام اجزاء واکنش به غیر از DNA و آغاز گر بود. 0/625 میکرو لیتر از هر آغازگر با غلظت 10 ماکرو مولار در لیتر و 10 میکرو لیتر از DNA با غلظت 10 نانوگرم در لیتر براي این مخلوط استفاده شد. از آنجایی که حجم نهایی این مخلوط 25 میکرولیتر بود، به منظور رساندن حجم مخلوط PCR به این مقدار از آب مقطر استریل استفاده شد
جدول -2مواد لازم و مقدار آنها براي تهیه محلول پایه PCR با استفاده از کیت PCR
برنامه PCR در این آزمایش شامل 3 دقیقه واسرشت سازي اولیه در 95 در جه سانتیگراد و در ادامه 34 چرخه شامل 30 ثانیه در 95 درجه سانتیگراد، 45 ثانیه در 53 درجه سانتیگراد و 1 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد بود و پس از اتمام چرخه ها 10 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد و در نهایت در دماي 4 درجه سانتیگراد تا زمان الکتروفورز بود. پس از انجام PCR مقدار 5 میکرولیتر از ماده رنگی برموفنل بلو به هر اپندرف اضافه شد و کاملا مخلوط گردید. سپس محصولات PCR روي ژل آگارز 2 درصد در بافر بارگذاري TBE شامل به مدت 1 ساعت و 45 دقیقه در ولتاژ 80 وات الکتروفورز گردیدند.
جهت تعیین اندازه باند هاي به دست آمده از سایز مارکر 1Kbp در غلظت 100 نانو گرم در میکرو لیتر استفاده شد که به مقدار 3 میکرولیتر در چاهک اول ژل ریخته شد. پس از پایان الکتروفورز، ژل با اتیدیوم بروماید سه میکرولیتر در لیتر از محلول پایه ا میکرو گرم در میلی لیتر به مدت 15 دقیقه رنگ آمیزي شد و پس از دو بار شست و شو با آب دو بار تقطیر - هر بار 10 دقیقه - با استفاده از دستگاه عکس برداري از ژل باند هاي به دست آمده مورد بررسی قرار گرفتند.
آغازگرهاي مورد استفاده در این آزمایش شامل SfF و SfR بودند که توسط محققانی چون چانون پیتات و همکاران - Channuntapipat et al., 2003 - به منظور تعیین آلل خود سازگاي در بادام به کار برده شده بودند. وجود باند دلیل بر خودسازگاري و عدم وجود باند دلیل بر خودناسازگاري بیان شدهاست.
جدول -3مشخصات آغاز گرهاي مورد استفاده براي تعیین آلل Sf در نتاج بادام
نتیجه و بحث
در پژوهش حاضر به منظور شناسایی ژنوتیپهاي خودسازگار و خودناسازگار حاصل از گردهافشانی آزاد رقم تونو موجود در باغ از روش PCR با آغازگرهاي اختصاصی استفاده شد. آغازگرهاي استفاده شده در این پژوهش، محدودهاي از اللهاي خودسازگاري و خودناسازگاري را در ژنوتیپهاي امیدبخش بادام تکثیر کردند. اندازهي اللهاي تکثیرشده توسط آغازگرهاي دژنره اینترون اول - PaConsI-F/EM-PC1consRD - ، از 270 جفت باز تا 700 جفت باز متغیر بود. بیشتر اندازهي اللها بین 200 تا 400 جفت باز بود و فقط اندازه باندهاي بزرگتر 590 و 700 جفت باز بود که نشانگر الل S1 میباشد که با نتایج گزارش شدهي عباديو همکاران - - 1391 و زینالعابدینیو همکاران - 1391 - همخوانی داشت.
