بخشی از مقاله
چکیده
نماتدهای مولد گره ریشه یکی از مهمترین بیمارگرهای گیاهی هستند که سالانه حدود ِ% از محصولات کشاورزی را از بین میبرند. استفاده از عوامل کنترل کننده ی بیولوژیک یکی از راه های پیشنهادی در راستای کشاورزی پایدار است. اگر عامل کنترل کننده بیولوژیک علاوه بر تاثیر مستقیم و پارازیته کردن بیمارگر، قادر به تحریک سیستم ایمنی گیاه نیز باشد، کارآیی آن بسیار بیشتر خواهد بود. قارچ Pochonia suchlasporia روی محیط آرد ذرت-آگار تکثیر شده و در مرحله دوبرگی مقدار ًٌ میلی لیتر سوسپانسیون اسپور با غلظت ًٌّ به هر گلدان اضافه گردید. پس از یک هفته گلدانها با تعداد ِ عدد تخم و لارو سن دوم در هر گرم خاک آلوده شدند. تیمارها شامل گیاه سالم - C - ، گیاه آلوده به نماتد - N - ، گیاه سالم تیمار شده با قارچ - - F و گیاه آلوده به نماتد در حضور قارچ - F+N - بود. فعالیت آنزیم های فنیل آلانین آمونیالیاز - PAL - و پلی فنل اکسیداز - - PPO در ریشه ی گیاه در روزهای فرد هفتهی اول پس از تلقیح با نماتد بررسی گردید. مقدار هر دو آنزیم در تمامی روزهای آزمایش در تیمار F+N حداکثر بود. فعالیت آنزیم PAL در تیمارهای حاوی قارچ F - و - F+N تا روز هفتم افزایش یافت ولی در تیمار N تا روز پنجم افزایش و سپس کاهش یافت. حداکثر فعالیت آنزیم PPO در روز پنجم آزمایش دیده شد و پس از آن کاهش یافت. با توجه به نتایج به دست آمده به نظر میرسد که قارچ قادر به فعال کردن سیستم ایمنی گیاه لوبیا سبز میباشد.
واژههای کلیدی: قارچ انگل نماتد، مقاومت سیستمیک اکتسابی، مقاومت سیستمیک القایی، نماتد ریشه گرهی
مقدمه
نماتدهای ریشه گرهی - root-knot nematodes - یکی از مهمترین انگل های گیاهی هستند که به بیش از ًًًٍ گونه گیاهی حمله کرده - Perry et al, 2009 - و سالانه خسارت قابل توجهی را به محصولات کشاورزی وارد میکنند. مقدار متوسط سالانه خسارت این نماتد به تنهایی در حدود ِ% تخمین زده میشود که در کشورهای در حال توسعه مقدار آن بیشتر است . - Karssen et al, 2013 - با توجه به اهمیت اقتصادی و مقدار خسارت این نماتدها مبارزه با آنها اجتناب ناپذیر است. روشی که در حال حاضر برای مبارزه با این نماتدها به کار گرفته میشود، استفاده از سموم شیمیایی است که علاوه بر آلودگی محیط زیست و آبهای زیرزمینی، گران بوده و احتمال بروز مقاومت نیز درآنها زیاد است . - Moosavi and Zare, 2012 - این موضوع پژوهشگران را واداشته است
تا به دنبال راه حل های جایگزین باشند. استراتژی جایگزین انتخاب شده باید بتواند بدون آسیب به محیط زیست، نماتد را در حد قابل قبولی کنترل کند . یکی از راههای مطمئن و منطبق با کشاورزی پایدار، استفاده از مبارزهگرهای بیولوژیک است - . - Cumagun and Moosavi, 2015 میکروارگانیسم های فراوانی در این رابطه آزمایش شدهاند که برخی از آنها نتایج امیدوار کننده ای از خود نشان داده اند، به گونه ای که در تعدادی از کشورها محصولات کنترل زیستی به صورت تجاری به بازار عرضه شده است. قارچ آنتاگونیست Pochonia suchlasporia یکی از بهترین آنتاگونیست های شناخته شده است که پتانسیل بالایی در کنترل بیماری های نماتدی دارد . - Moosavi and Zare, 2012 -
استفاده از مقاومت ذاتی گیاه و تحریک سیستم ایمنی آن روش پیشنهادی دیگری است که می تواند بدون آسیب به محیط زیست و موجودات غیر هدف، انگل های گیاهی را کنترل کند - . - Walters, 2011 مقاومت القایی به عنوان کلیه واکنش هایی که به فعال شدن مقاومت گیاه از طریق ایجاد موانع فیزیکی و شیمیایی در برابر عوامل زنده یا غیر زنده بیمارگر منجر میگردد، تعریف شده است . - Conrath, 2009 - گیاهان نیز مثل بقیه موجودات دارای تعداد زیادی مکانیزمهای دفاعی بر علیه پاتوژنها هستند. در مواقع ضروری و در صورت آلوده شدن با بیمارگرها، گیاهان قادرند از این مکانیزمهای استفاده کرده و از خودشان محافظت کنند. این نوع مقاومت القایی، مقاومت اکتسابی - Acquired Resistance - نامیده میشود که میتواند هم به صورت موضعی و هم به صورت سیستمیک - SAR - Systemic Acquired Resistance باشد. این نوع مقاومت گیاهان را در برابر دامنه وسیعی از پاتوژنها محافظت کرده و در خیلی از موارد به صورت سیستمیک عمل میکند . - Grant and Jones , 2009 - اگر عامل کنترل کننده ی بیولوژیکی علاوه بر مبارزهی مستقیم با نماتد، قادر به فعال کردن سیستم دفاعی گیاه نیز باشد، ارزش آن چند برابر خواهد بود . - Walters and Bennett, 2014 - در این تحقیق با انگیزه حفظ محیط زیست در کشاورزی پایدار، تاثیر قارچ Pochonia suchlasporia و نماتد مولد گره ریشه - Meloidogyne - javanica به تنهایی و در ترکیب با یکدیگر در تحریک تولید برخی ترکیبات دفاعی گیاه مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت و با گیاه شاهد مقایسه خواهد گردید.
ٍ- روش تحقیق تهیه نمونه قارچ
جدایه قارچ P. suchlasporia از کلکسیون قارچ های زنده ی دانشگاه آزاد اسلامی واحد مرودشت تهیه شد. یک نسخه از این قارچ در کلکسیون قارچهای ایران با کد IRAN 1127 C و یک نسخه ی دیگر در کلکسیون قارچهای هلند با کد CBS 425.80B موجود میباشد. این قارچ از سیست نماتد چغندر قند و در کشور هلند جداسازی، شناسایی و خالص شده است. این جدایه تا زمان انجام آزمایش روی محیط کشت سیب زمینی دکستروز آگار - PDA - کشت و نگهداری گردید.
تهیه مایه تلقیح نماتد
نماتدی که قبلا از مزرعه گوجه فرنگی جداسازی شده بود و گونهی آن تشخیص داده شده بود - Moosavi et al, - 2007 به صورت تک توده تخم روی گیاه لوبیا رقم جماران تکثیر شد تا جمعیت کافی برای آلوده سازی تیمارهای آزمایش به دست آید.
تهیه مایه تلقیح قارچی
قارچ روی محیط آرد ذرت-آگار - corn meal agar - کشت داده شده و به مدت دو هفته در دمای C ٍ ٍَ تکثیر شد. پنج میلی لیتر آب مقطر استریل در ظروف پتری ریخته شده و سطح پتری با میله شیشه ای استریل خراش داده شد. سوسپانسیون اسپور جمع آوری گردید و جمعیت اسپور قارچ توسط هموسایتومتر شمارش گردید. تعداد اسپورها در هر میلی لیتر سوسپانسیون روی ًٌّ عدد تنظیم گردید.
بررسی فعالیت آنزیمهای دفاعی گیاه
در گلدان ها از خاک استریل استفاده شد. بدین منظور خاک معمولی باغچه و ماسه به نسبت ٌٍْ با یکدیگر مخلوط و سه بار به فاصله زمانی ٍُ ساعته اتوکلاو گردید. بذر لوبیا سبز - رقم جماران - در گلدان کاشته شده و در مرحله دوبرگی با ًٌ میلی لیتر سوسپانسیون اسپور جاوی ًٌّ عدد اسپور در هر میلی لیتر تلقیح گردید. یک هفته بعد به گلدان هایی که باید با نماتد آلوده می شدند، تعداد ِ عدد تخم و لارو سن دوم به ازای هر گرم خاک اضافه گردید. تیمارهای آزمایش شامل گیاه سالم - C - ، گیاه سالم تیمار شده با قارچ - F - ، گیاه آلوده به نماتد - - N و گیاه آلوده به نماتد در حضور قارچ - F+N - بود. نمونه ریشههای آلوده به نماتد جهت بررسی تغییرات آنزیم های دفاعی گیاه به مدت یک هفته و به صورت یک روز در میان بعد از تزریق نماتد جمع آوری شد. ریشه های خارج شده از گلدان بوسیله آب شستشو داده شده و با کاغذ صافی خشک گردیدند. یک گرم بافت ریشه گیاه در هاون چینی به همراه ازت مایع له شده و سپس به این بافت، بافر ًٌ میلی مولار فسفات سدیم دارای ّpH= با دمای ُ درجه سانتی گراد اضافه شد و در نهایت بوسیله صافی ٍ میلیمتری، صاف و با سانتریفیوژ با سرعت ًًًٌٍ دور در دقیقه در دمای ُ درجه سانتیگراد سانتریفوژ گردید. عصاره بدست آمده جهت بررسی نسبت آنزیمهای مقاومتی در گیاه استفاده شد . - Sahebani and Hadavi, 2008 -
بررسی فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز - PAL -
فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز - PAL; EC 4.3.1.24 - به صورت زیر تعیین گردید - Ochoa-Alejo and . - Gomez-Peralta, 1993 یک میلی لیتر از بافر ًِ میلی مولار Tris-HCl - اسیدیته َ/َ و حاوی 15 میلی مولار بتا مرکاپتو اتانول - با ِ/ً میلی لیتر L-phenylalanine ًٌ میلی مولار، ُ/ً میلی لیتر آب دیونیزه و ٌ/ً میلی لیتر عصاره ی آنزیمی استخراج شده مخلوط شده و ترکیب حاصله به مدت یک ساعت در °Cٍْ نگهداری شد. واکنش با افزودن ِ/ً میلی لیتر اسید کلریدریک ّ مولار به لولهها متوقف شد و سپس ٌِ میلیلیتر اتیل استات به محلول حاصل افزوده گردید تا محصول استخراج گردد. فاز غیر روغنی جدا و در دمای °Cٍٍ قرار داده شد تا تبخیر شود. پس از تبخیر فاز مایع، سینامیک اسید باقی مانده در سه میلیلیتر سود ًِ/ً مولار حل شده و غلظت آن توسط اسپکتروفتومتر - Perkin Elmer lambda-45 - در طول موج ًٍُ نانومتر محاسبه گردید. جذب نور در طول موج ًٍُ نانومتر به عنوان مقیاسی از تولید سینامیک اسید در نظر گرفته شد . - Chen et al , 2000 -
ارزیابی فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز - PPO -
فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز - PPO; EC 1.14.18.1 - به وسیله مخلوط کردن بافر سیترات-فسفات ٍِ میلی مولار - pH 6.4 - با مقداری از عصارهی استخراج شده که حاوی ًَ میکروگرم پروتیین باشد و رساندن حجم نهایی به یک میلی لیتر با -Lپرولین - L-proline - ِ میلی مولار تعیین گردید. نمونه ها به مدت ٍ دقیقه در یک لوله به کمک ورتکس - Vortex - کاملا هوادهی و مخلوط شده و دستگاه اسپکتروفتومتر با آن صفر گردید . واکنش از طریق افزودن پیروکتکول - pyrocatechol =1, 2-dihydroxybenzene - به عنوان سوبسترا به گونه ای که غلظت نهایی آن ًٍ میلی مولار شود شروع گردید. جذب نور با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ٌِِ نانومتر - PD[ 515QP - قرائت شد. پس از انجام واکنش، اندازهگیری فعالیت آنزیم در دمای ٍِ درجه سانتی گراد و به مدت یک دقیقه و با فواصل زمانی ًٌ ثانیه اندازه گیری شد. فعالیت آنزیم PPO به صورت تغییرات در میزان جذب در دقیقه در میلی گرم پروتیین - changes in absorbance - A - / min / mg protein - بیان گردید. از
