بخشی از مقاله
چکیده
طی فصل بهار و اوایل تابستان سال 1394، از باغات انگور چند شهرستان از استان آذربایجان شرقی بازدید و از علائم بیماری گال طوقه نمونه برداری و به آزمایشگاه منتقل شد. از کشت نمونه ها 30 جدایه باکتری روی محیط کشت آگار مغذی جداسازی شد. در آزمون بیماریزایی، جدایه ها پس از سه هفته توانستند روی ساقه گوجه فرنگی گال تولید کنند. براساس مجموع ویژگی های فنوتیپی از جمله استفاده از منابع مختلف کربنی، جدایه های عامل بیماری گال طوقه انگور به عنوان Agrobacterium tumefaciens شناسایی شدند.
برای بررسی راههای کنترلی این باکتری در شرایط آزمایشگاهی، از خاک اطراف ریشه گیاهان سالم انگور نمونه برداری و پس از انتقال به آزمایشگاه کشت گردیدند. جدایه های باکتری های بدست آمده در شرایط آزمایشگاهی به روش کشت سه نقطه ای علیه باکتری بیمارگر - A. tumefaciens - مورد ارزیابی قرار گرفتند.
از بین جدایه های ریزوسفر، تنها دو جدایه توان کنترلی روی آگروباکتریوم را داشتند که به ترتیب دارای هاله ی کنترلی 8,25 و 8,3 میلیمتری داشتند. ژن 16S rRNA جدایه های آنتاگونیست توالی یابی و پس از مقایسه با سایر توالیهای باکتری های موجود در بانک ژن و همچنین رسم درخت فیلوژنی مشخص گردید که جدایه S1، به جدایه Bacillus subtilis و جدایه S2 به Pseudomonas fluorescens شباهت بالای 99 درصد را دارند.
.1 مقدمه و هدف
تاک یا انگور - Vitis vinifera - گونه ای از خانواده انگورسانان - Vitaceae - است. در این خانواده 11 جنس و بیش از 600 گونه وجود دارد که مهمترین جنس این خانواده جنس انگور - - Vitis است .[1] گیاهان دو لپه در بیش از پنجاه خانواده اعم از درختان مثمر و غیرمثمر، گیاهان زراعی، زینتی و تعدادی از گونه های مهم بازدانه به باکتری عامل بیماری گال یا سرطان طوقه آلوده میشوند.
شیوع و گسترش این بیماری در سالهای اخیر باعث زوال و مرگ برخی از درختان میوه به خصوص تاک شده و تهدیدی جدی برای این گونه محصولات تلقی می شود . بیماری گال طوقه به دلیل رشد غیر عادی وبیش از حد متعارف ریشه ها و گسستگی بافت آوندی در ریشه، طوقه و ساقه باعث کاهش رشد وکوتولگی گیاهان می شود. رشد ساپروفیتی باکتری روی بقایای طبیعی گیاهان در خاک صورت می پذیرد، بنابراین مهم ترین راه کنترل بیماری گال طوقه از بین بردن گیاهان دارای علائم ، گیاهان بالقوه حساس ولی فاقد علائم و همچنین بقایای گیاهی موجود درخاک می باشد.
جدایه های بیماری زای باکتری حامل یک پلازمید بزرگ - پلازمید - Ti هستند که بیماریزایی با ایفای وظیفه دو منطقه مختلف از پلازمید شامل قسمت T-DNA وناحیه ژنهای بیماریزایی - Vir - صورت می پذیرد. برای بیماریزایی T-DNA به داخل سلول های گیاهی انتقال می یاید و دریکی از رشته های کروموزومی سلول آلوده شده وارد شده و یا در آن ادغام می شود.
برجستگی های معمولا گرد به نام گال، تومور و غده به قطر چند میلی متر تا چند سانتیمتر در محل طوقه و شاخه های انگور در اثر آلودگی به اگروباکتریوم ایجاد می گردد. ممکن است گال های بزرگی بسته به شدت بیماریزایی جدایه، دامنه حساسیت ارقام انگور و شرایط محیطی دور تنه تاک جوان را در طول یک فصل رشد احاطه نماید. تاک های دارای گال به طور کلی شاخه های جوان ضعیفی تولید می کنند و قسمت های بالای گال ممکن است از بین رفته و خوشه های کم و ضعیف تشکیل گردد .[18] گال ها بندرت روی ریشه ها دیده می شوند اما باکتری ممکن است سبب ایجاد زخمهای مرده و تیره رنگ روی ریشه گردد
کنترل بیماری گال طوقه با توجه به دامنه وسیع میزبانی آن و قابلیت بقا در محیطهای مختلف از قبیل خاک و آب آبیاری بسیار دشوار است. شکستن مقاومت گیاه اغلب به دلیل تنوع ژنی بالای استرینهای بیماریزا و فعل و انفعالات زیست محیطی مشاهده میشود. از طرفی مصرف فراوان انواع سموم و کودهای شیمیایی چه از لحاظ تأثیر بر سلامت مصرفکنندگان محصولات کشاورزی و غذایی و چه از لحاظ تبعات زیست محیطی از قبیل آلودگی آبهای زیرزمینی و برهم زدن تعادل زیستی، روز بهروز مورد تردید جدی قرار میگیرد.
با توجه به افزایش مصرف سموم شیمیایی برای کنترل بیماری-های گیاهی که پیامد آن زوال باروری خاک، آلودگی هوا، آب و غذا است، امروزه رویکرد جهانی به سمت استفاده از سموم جایگزینی است که علیرغم کاربرد آنها در عملیات کشاورزی پایدار، محیط زیست هم مورد تهدید قرار نمیگیرد. در این میان، میکروارگانیسمهای مفید مرتبط با گیاهان بهویژه باکتریهای ریزوسفر گیاهان بهلحاظ داشتن پتانسیل بالقوه در کنترل باکتری عامل بیماری میتوانند جایگزین مناسبی در این خصوص باشند. در حال حاضر کنترل بیولوژیک عوامل بیماریزای گیاهی با استفاده از میکروارگانیسمهای مفید جایگاه بسیار مهمی را در برنامههای مدیریتی پیدا کرده است.
.2 تئوری و پیشینه تحقیق
Agrobacterium و Rhizobium براساس ویژگی های ریبوزمی در شاخه Protobacteria، رده - protobacteria و خانواده Rhizobiaceae قرار داده شده است .[20,21] بررسی توالی های 16S rRNA اگروباکتریوم ها و ریزوبیوم ها و تحلیل نتایج با روش آنالیز و روش تحلیلی، جنس های Agrobacterium و Rhizobium را معتبر می شمارد، بر اساس داده های حاصل از rRNA ، گونه های A.vitis و A.rubi دارای ماهیتی اختصاصی و معتبر می باشند.
آنالیز فیلوژنتیکی 15 جدایه از گونه های مختلف اگروباکتریوم و ریزوبیوم بر اساس توالی کامل ژن 16S rRNA رابطه نزدیک این دو جنس را نشان داد به طوریکه گونه های این دو جنس در خوشه های یکسان و مجاور قرار گرفته و تفکیک آنها از یکدیگر ممکن نیست.
در سال 1998 یک گروه اسپانیایی با بررسی نقوش RNA با وزن مولکولی پائین، اعلام کردند که دو جنس Rhizobium و Agrobacterium بسیار شبیه هم بوده و جدایه ها از دیگر اعضای خانواده Rhizobiaceae قابل تفکیک هستند.
یانگ و همکاران بر اساس توالی 16S rRNA آگروباکتریوم های بیماریزا در گیاهان را متعلق به ریزوبیوم دانسته و گونه های Agrobacterium را به گونه های Rhizobium تغییر نام دادند. علائم بیماری گال طوقه ابتدا در سال 1853 از روی انگور در اروپا گزارش و اولین بار در آمریکا در سال 1904 باکتری عامل بیماری جداسازی گردید.
سوادا و همکاران [15] با بررسی خصوصیات فنوتیپی 108 جدایه اگروباکتریوم بدست آمده از میزبانهای مختلف را در 5 گروه قرار دادند. بوزار و همکاران[4] خصوصیات افتراقی فیزیولوژیک و بیوشیمیایی را در بین اعضای این جنس بررسی نمودند.
وقوع سرطان طوقه انگور در ایران نخستین بار توسط امانی در سال 1345 ازقزوین گزارش گردید.[2] در پی آن آلودگی در چندین استان کشور مشاهده شد. سرطان طوقه انگور در سال 1372 از استان فارس و کهگیلویه و بویر احمد گزارش گردید .[1] در سال 1377 باکتری عامل از تاکستان های کرج و تاکستان جدا و تحت گونه A.vitis شناسایی گردید.[8] همچنین در سال 1379 به یک مورد اگروباکتریوم بیووار 1 در میان جدایه های A.vitis در تاکستان های کهگیلویه و بویر احمد اشاره شد
صالحی و همکاران در سال 1385 تنوع جمعیت های اگروباکتریوم بدست آمده از گیاهان باغی و زینتی درچند نقطه کشور را ارزیابی و جدایه ها را از نظر فنوتیپی به 3 گروه تقسیم بندی کردند. جدایه های A.tumefaciens بزرگ ترین گروه را تشکیل داده و جدایه های بدست آمده از تاک نیز بیشترین شباهت فنوتیپی را به A.tumefaciens داشتند. گروه سوم شامل جدایه هایی بودند که از گیلاس استان تهران جدا گردیده و شدت بیماریزایی کم و طیف منابع کربن قابل استفاده محدودی داشتند. جدایه ها در آزمون BOX-PCR تنوع وسیعی داشتند.
.3 مواد و روش ها
نمونه برداری و جداسازی
در سال 1394 از تاکستان های مناطق مختلف استان آذربایجان شرقی - شهرستان های بناب، ملکان و عجب شیر - بازدید و نمونههایی از ساقه و طوقه های تاک دارای گال سفید و به ظاهر در حال رشد برداشته شد. نمونه های گال در پاکت های کاغذی قرار داده شده و به آزمایشگاه منتقل گردید. برای جداسازی ، گالها ابتدا با آب معمولی و بعد با آب مقطر شسته و سپس با محلول هیپوکلریت سدیم یک درصد به مدت 10 دقیقه ضدعفونی سطحی شدند.
نمونه ها بعد از شستشو با آب مقطر ، داخل پتری های استریل حاوی چند قطره آب مقطر استریل به قطعات کوچکتر خرد شده و پس از 30 دقیقه نگهداری در شرایط استریل، یک قطره از سوسپانسیون حاصل روی محیط نوترینت آگار - NA - مخطط شده و پتری دیش ها در دمای 25-28درجه سلیوس نگهداری شدند.[17] پس از گذشت2-3 روز پرگنه های شبیه به Agrobacterium - پرگنه های سفید رنگ ، محدب با حاشیه صاف - انتخاب گردید.
اثبات بیماریزایی
جدایه ها روی محیط نوترینت آگار حاوی سوکروز - NAS - در دمای 28 درجه سلسیوس کشت داده شدند. بعد از 24 ساعت، با سوزن استریل مقداری از کلنی باکتریها برداشته شده و با ایجاد زخم بر روی ساقه جوان گوجه فرنگی مایه زنی گردیدند. گیاهان مایهزنی شده به مدت 3-4 هفته در گلخانه با دمای 22-28 درجه سلسیوس نگهداری شدند. برای شناسایی باکتری عامل گال طوقه مو، آزمونهای رشد هوازی و بی هوازی به روش هیو و لایفسن، آزمون اکسیداز به روش اوینگ- جانسون ، اکسیداسیون لاکتوز به -3کتولاکتوز به روش برنارت و دی لی ، استفاده از مالونات وسیترات به روش لیفسن وسیمونز، ایجاد پلیکل در محیط فریک آمونیوم سیترات به روش هندریکسن، اوره از ، تحمل نمک %2 ، هیدرولیز ژلاتین، هیدرولیز اسکولین، اثر روی شیر لیتموس ، تولید گاز H2S از سیستئین ، رشد در دمای 35 درجه سلسیوس به روش شاد، آزمون ارژنین د هیدرولاز به روش تورنلی و تولید اندول و کاتالاز به روش شاد انجام شد.[17] استفاده از منابع کربنی با استفاده از محیط پایه آیر وهمکاران و به روش شاد انجام شد.
جداسازی باکتریهای آنتاگونیست
جهت جداسازی باکتریهای آنتاگونیست، خاک فراریشه گیاهان سالم از باغات انگور استان آذربایجان شرقی جمعآوری و به صورت جداگانه درون پاکتهای کاغذی به آزمایشگاه انتقال داده شد و سپس یک گرم از خاک چسبیده به ریشه در 9 میلی-لیتر آب مقطر استریل ریخته و با ورتکس بههم زده شد تا بهصورت سوسپانسیون در آید. غلظتهای مختلف به روش سری رقت تهیه شد بهاین ترتیب که توسط پیپت استریل یک میلیلیتر از این سوسپانسیون، به یک لوله آزمایش دیگر محتوی 9 میلیلیتر آب مقطر استریل انتقال داده شده و این مراحل تا بدست آمدن رقت 10-3 ادامه یافت.
