بخشی از مقاله
مقدمه
پاتوژنهای خاکزاد با حمله به بافتهای ریشه و طوقه و کاهش توانایی آنها به منظور جذب آب و مواد مغذی همراه هستند. در خاک-های زیر کشت گندم، پاتوژنهای خاکزاد به طور گستردهای پخش شدهاند و میتوانند منجر به زیانهای اقتصادی در عملکرد شوند. از جمله عوامل اصلی این بیماریها قارچهای خاکزی متعلق به جنسهای
Fusarium، Rhizoctonia، Bipolaris و
Gaeumannomyces میباشند(.(1 قارچ Gaeumannomyces از مهمترین عوامل بیماریزای خاک میباشد . گونهی G.graminis مهمترین گونهی جنس Gaeumannomyces است که به غلات و سایر گرامینهها حمله می کند. واریتهی بیماریزای آن روی گندم با نام Gaeumannomyces graminis var. tritici (Ggt) توسط والکر1
نامگذاری شد که باعث بروز بیماری خطرناک پاخوره یا پاسوزه2 در تمام مناطق گندمخیز دنیا میشود(.(2 بنابر اظهارات ترولدنیر، این بیماری پس از زنگ سیاه، دومین بیماری مخرب گندم در جهان است. در گیاهان آلوده علائم بیماری عمداًت در زمان خوشهدهی ظاهر میشود. بوتهها ارتفاع نابرابر دارند و خوشههای آلوده به طور معمول کوچکتر و سفید هستند که اصطلاحاً سرسفیدی3 نامیده میشود . از علائم بارز پاخوره سیاهشدگی ریشههاست که ممکن است از همان مراحل اولیهی رشد گیاهچهای خود را نشان دهد(.(3 در حال حاضر بهترین مدیریت Take-all تناوب زراعی با فاصله از گندم، جو و یا گراسهای مستعد برای مدت یک یا دو سال بسته به خاک و منطقهی آب و هوایی است. از آنجا که تا کنون قارچکش موثر و هیچ منبع مقاومتی در برابر این بیماری شناخته نشده، در سالهای اخیر مطالعه به منظور استفاده از ارگانیسمهای همراه گیاه و موجود در خاک در شرایط آزمایشگاهی، گلخانهای و پلاتهای مزرعهای در حال انجام است(.(4 سنفورد و برادفوت(5)4 اثر بازدارندگی شش گونه قارچ، 15 استرین باکتری و یک گونه اکتینومیست را روی عامل پاخوره در شرایط گلخانه مورد بررسی قرار دادند. در مطالعاتی که توسط کوک و همکاران(6)5 با استفاده از
Pseudomonas aureofaciens 30-84 در مزرعه انجام شد توانستند بیماری پاخوره را تا حد مطلوبی کنترل کنند. بال(7)6 برای اولین بار ثابت کرد که فنازین نقش مهمی در کنترل عامل پاخوره دارد. همچنین تامشو و ولر(8)7 تولید و تاثیر این آنتی بیوتیک را توسط سودوموناسها
1 Walker 2 Take-all 3 White head
4 Sanford& Broadfood 5 Cook et al 6 Bull
7 Thomashow & Weller
اثبات نمودند. ولر و کوک((9 با به کارگیری دو استرین
P. fluorescens 79 به صورت تنهایی و مخلوط با هم بیماری پاخوره را در گندمهای بهاره و زمستانه کاهش دادند و نشان دادند ترکیب دو استرین نسبت به هر کدام به تنهایی تأثیر بازدارندگی بیشتری روی بیماری پاخوره دارد. رایدر و همکاران(10)8 از استرینهای Bacillus cereus A47 و B. subtilis B908 جدا شده در چین جهت سرکوب شدت Take-all در خاکهای استرالیا استفاده کردند. میزان کنترل بیماری به آنچه که با ایزولهی بیوکنترلی Pseudomonas corrugata 2140 بدست آمده بود شبیه بود. لذا در سالهای اخیر ظهور نژادهای جدید پاتوژن و بروز مقاومت در آنها ناشی از مصرف بیرویهی سموم نگرانیهایی را در پی داشته که لزوم به کارگیری عوامل کنترل بیولوژیک طبیعی را مهم کرده است.
-2 مواد و روشها
1-2 نمونهبرداری از مزارع آلوده به Ggt
در طول فصل رشد از مزارع مختلف شهرستانهای اسـتان همـدان با علائم واضح همچون پاچ)9لکههایی در مزرعه کـه نسـبت بـه اطـراف خود کوتاه-قد و کم تراکم هستند)، سبزخشکی و سیاهشدگی طوقـه و ریشه نمونهبرداری به منظور جداسازی قارچ عامل پـاخوره انجـام شـد. نمونهها درون پاکت کاغذی قرارگرفت و به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2 جداسازی و شناسایی قارچ عامل بیمـاری پـاخورهی
گندم
قسمتهای اضافی نمونهها غیر از طوقه و ریشـههـا را قطـع کـرده، آنها را به مدت چند دقیقه در آب جاری شسته تا گلولای چسبیده به ریشهها جدا شود. سپس بر اسـاس کیفیـت علـائم روی نمونـههـا و بـا اولویت طوقه، قطعاتی بـه انـدازهی 10-5 میلـیمتـر از هـر نمونـه بـه وسیلهی قیچی بریده، نمونهها را در شرایط استریل در وایتکس تجاری 10 -5 درصد به مدت 1/5 دقیقه برای قطعات ریشه و 2 دقیقـه بـرای قطعات طوقه ضدعفونی سطحی و به آب مقطر اسـتریل منتقـل کـرده، سپس روی کاغذ صافی قرار داده و پس از خشک کردن چهار قطعـهی استریل از نمونههای آلوده در چهار طـرف تشـتک پتـری روی محـیط کشت نیمه انتخابی R-PDA قرار داده شد. تشتکهـا در انکوبـاتور بـا دمای 24 درجهی سانتیگراد نگهـداری شـدند. واکـنش ایجـاد هالـهی بنفش در صورت آلوده بودن بافت به Ggt و چند قارچ مشکوک، پس از 24 ساعت مورد بررسی قرار گرفت ومراحل خالصسازی و شناسایی به روش نوک هیف و براساس کلیدهای شناسایی انجام شد.
3-2 آزمون اثبات بیماریزایی قارچ عامل پاخورهی گندم
8 Ryder et al 9 Patch
به منظور اثبات بیماریزایی از بذور گندم رقم پیشگام تهیه شده از مرکز تحقیقات کشاورزی استان همدان استفاده شد. مخلوطی از خاک، ماسه و کود حیوانی با نسبت((2:1:1 در کیسههای نایلونی ریخته شد و در اتوکلاو مخصوص پاستوریزه کردن خاک در دمای 120 درجهی سانتیگراد به مدت یک ساعت پاستوریزه گردیدند. سپس از گلدانهای با قطر 10 سانتیمتر استفاده گردید و تا 5 سانتیمتری از لبهی گلدان پر از خاک شدند. سپس پرگنهی پنج روزهی قارچ عامل که روی PDA ضعیف شده رشد کرده بود به طور کامل با محیط کشت روی سطح خاک قرار گرفت و با سوزنهای استریل تعدادی سوراخ روی آن جهت نفوذ آب ایجاد شد. سپس روی سطح پرگنه یک سانتیمتر خاک استریل ریخته شد و پنج عدد بذر گندم(برای بیماری-زایی روی یولاف از پنج عدد بذر یولاف استفاده شد) را که قبلاً با وایتکس ضدعفونی شده بود روی سطح خاک قرار داده شد و مجدداً یک سانتیمتر خاک روی بذرها ریخته شد و به آرامی آبیاری شدند. برای شاهد فقط از PDA ضعیف شده با همان ضخامت استفاده شد. گلدانها در گلخانه و در شرایط دمایی 18-25 درجهی سانتیگراد قرار گرفتند و مرتب براساس نیاز آبی آبیاری شدند. ارزیابی برای بیماری-زایی پس از 40 روز و برای تولید پریتسیوم پس از دو ماه انجام شد.
4-2 نمونهبرداری و جداسازی آنتاگونیستهای باکتریایی
جمع آوری نمونهها از مزارع استان همدان انجام شد و نمونهها داخل پاکتهای پلاستیکی به آزمایشگاه منتقل شدند. جهت جداسازی باکتریهای اندوفیت ابتدا قطعات ریشهی گندم شاداب را تهیه، پس از ضدعفونی سطحی به مدت یک دقیقه در وایتکس یک درصد از ماده تجاری، نمونهها را چند بار شسته تا وایتکس کاملا خارج شود، سپس یک گرم از برگ را خرد کرده و در 50 میلیلیتر آب مقطر استریل حاوی یک درصد ژلاتین به مدت 20-30 دقیقه با 120 rpm شیکر شدند. در نهایت از سوسپانسیون به دست آمده یک لوپ روی محیط آگار مغذی(1(NA حاوی یک گرم در لیتر عصارهی مخمر به صورت مخطط کشت دادهشد(استریک) وتا زمان ظاهر شدن کلنیهای باکتری درون انکوباتور دردمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. از هر تشتک پتری کلنیهایی که از نظر ظاهر متفاوت بودند، به تشتک پتری جدید منتقل گردیدند. جهت اطمینان از خالصسازی، باکتریها دوباره به صورت مخطط کشت داده شدند. در مجموع 30 پرگنه از تشتکهای پتری انتخاب و نگهداری شدند
5-2 بررسی اثرات آنتاگونیستی باکتریها روی قارچ عامل
پاخورهی گندم در شرایط آزمایشگاهی
به منظور اثبات تولید آنتیبیوتیک توسط باکتری از روش کراوس و لوپر2 استفاده شد .(11) در این روش استرینهای آنتاگونیست روی
1 Nutrient agar 2 Kraus & Loper
PDA حاوی 1 گرم در لیتر عصارهی مخمر به مدت 4 روز روی محیط آگار مغذی حاوی 2 درصد گلوکز به صورت لکهای کشت شدند. سپس کلنیهای رشد یافته از سطح محیط به وسیلهی پنبهی استریل جمع-آوری شدند .برای اطمینان از عدم رشد بقایای کلنی از روش قرار دادن پنبه اغشته به فرمالین %40 استفاده شد. عدم رشد قارچ روی این محیط با رشد قارچ روی محیط شاهد که در آن باکتری کشت نشده بود مقایسه شد که این نشاندهندهی وجود آنتیبیوتیک درون محیط غذایی تلقی شد. . با در نظر گرفتن ویژگیهای مرفولوژیکی و انجام تستهای بیوشیمیایی توصیه شده توسط شاد و همکاران و همچنین جدایه-های موفق به تشکیل هالهی بازدارنده گروهبندی اولیه انجام و نه نماینده به منظور انجام آزمایشات گلخانهای انتخاب شدند.
6-2 بررسی اثرات آنتاگونیستی باکتریها روی قارچ عامل
بیماری پاخورهی گندم در شرایط گلخانه
به منظور آمادهسازی یک مایه تلقیح با قدرت بیماریزایی بالا از دانههای یولاف به صورت زیر استفاده شد: دانههای یولاف(200گرم) به مدت 24 ساعت در آب(200 میلیلیتر) در دمای اتاق خیسانده شدند. سپس به فلاسک Erlenmyer منتقل و به مدت 30 دقیقه در دمای 121 درجهی سانتیگراد در سه روز متوالی اتوکلاو شدند. یک تشتک پتری حاوی محیط کشت(با قطر 9 سانتیمتر) Ggt روی PDA به مربعهای کوچک خورد شده و با 200 گرم دانهی یولاف اتوکلاو شده مخلوط شد. و در دمای 20 درجهی سانتیگراد قرار گرفتند. جهت اجتناب از به هم چسبیدن دانهها به یکدیگر و نیز برای نفوذ به همهی قسمتها، محتویات فلاسکها هر روز به هم زده شد پس از گذشت 3 هفته، دانههای یولاف کلونیزه شده از داخل فلاسکها خارج، هواخشک شده وجهت یک دست شدن آسیاب شد و در دمای 4 درجهی سانتی-گراد نگهداری شدند. تا به منظور تلقیح مصنوعی خاک برای آزمایش-های گلخانهای مورد استفاده قرار گیرند(.(12 برای تهیهی مایه تلقیح باکتریهای آنتاگونیست نیز از کشت 24 تا 48 ساعتهی باکتری روی محیط کشت آگار مغذی استفاده شد. سپس جذب نوری آن در طول موج 600 نانومتر و OD= /1 توسط دستگاه اسپکتروفتومتر تنظیم شد. هر گلدان(20cm ارتفاع، 20cm قطر) با 700 گرم خاک(مخلوط خاک:ماسه: کود، (2:1:1 حاوی 7 گرم Ggt که روی دانههای یولاف رشد کرده بود پر شد. هشت دانهی گندم استریل شده (رقم پیشگام) کاشته شد و دانهها با لایهی 2 سانتیمتری از خاک پوشانده شدند. گلدانها با سوسپانسیون cfuml-1106 استرینهای آنتاگونیست روی سطح خاک گلدان(30 میلیلیتر)توسط خیساندن خاک بلافاصله بعد از کاشت به کار برده شد. گلدانها به طور تصادفی در گلخانه توزیع شدند و به طور هفتگی موقعیت آنها جهت جلوگیری از هرگونه اثرات موقعیتی عوض شد. گلدانها دوبار در هفته آبیاری شدند.
-3 نتایج و بحث
1-3 شناسایی قارچ عامل بیماری پاخورهی گندم
در هنگام جداسازی از بافتهای آلوده واکنش تغییـر رنـگ محـیط کشت R-dPDA به بنفش مشاهده شد. در مراحل بعـدی شناسـایی و پس از اطمینان از خصوصیات قارچ مورد نظر مجددا روی ایـن محـیط کشت، کشت داده شد و هالهی بنفش دیده شد. ایجاد و ظهـور هالـهی بنفش روی محیط کشت نارنجی R-dPDA با مشاهدههای دوفی و ولر منطبق بود(.( 13 هیفوپودیومهای قارچ Ggt به صـورت سـاده و بـدون لوب مشاهده شدند(شکل.(1 تولید پریتسیوم در مرحلهی آزمون اثبـات بیماریزایی به خوبی مشاهده شد.
×الف ب
شکل.1 الف- رشد قارچ روی محیط PDA ؛ ب- ریسه و هیفوپودیوم
Ggt
2-3 باکتریهای آنتاگونیست
استرینهای باکتریایی بر اساس خصوصیات مرفولوژیکی روی محیط کشت و نتایج آزمونهای بیوشـیمیایی گـروهبنـدی و در نهایـت چهـار جدایه جهت انجام آزمایشـات گلخانـهای بـه عنـوان نماینـده انتخـاب شدند.(جدول(1
جدول -1 ویژگیهای بیوشیمیایی باکتریهای جدا شده از گندم
×تست B4 B7 B21 B26
گرم -× -× -× -×
واکنش فوق -× -× -× -×
حساسیت روی
×شمعدانی
×اکسیداز -× +× -× -×
×کاتالاز +× +× +× +×
O/F o o o o
تولید رنگدانهی -× +× -× -×
×فلئورسنت
کشت روی محیط -× -× +× -×
YDC
رشد در 4 C +× +× -× +×
رشد در 41 C -× -× - W
تولید رنگ سبز -× -× -× -×
متالیک در مجیط
EMB×کشت
×رشد در %6 نمک +× +× +× +×
×آرژنین دی هیدرولاز Nd +× -× +×
×لوان -× +× -× -×
تغییر رنگ روی -× -× -× +×
محیط TTC
:+انجام واکنش؛ -: عدم انجام واکنش؛ :Nd نامشخص؛ :W ضعیف
نتایج با کمک کلیدهای شناسایی معتبر از جمله شـاد و همکـاران((14 مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که ایـن جدایـه هـا بـه ترتیـب متعلــق بــه جــنسهــای:B7،Pseudomonas fluorescens ؛B4
Pseudomonas sp؛ Xanthomonas spB21؛B26، Ralstonia sp
و بودند.
3-3 اثر باکتریهای جداشده از گندم بر پارامترهای رشدی
گندم تلقیح شده با قارچ عامل پاخوره
در آزمایشهای گلخانهای، اثر چهار نمایندهی باکتری بر روی ارتفاع اندام هوایی و همچنـین طـول ریشـه بـه روش آغشـتهسـازی بـذر بـه سوسپانسیون باکتری مورد بررسی قرار گرفت. اثر تعامل این باکتریهـا در حضور قارچ عامل پاخوره با تجزیهی دادههای حاصل به کمک نـرم-افزار SAS در قالب طرح بلوک کامل تصادفی در 3 تکـرار انجـام شـد. نتایج نشان داد گیاهانی که بذرشان آغشته بـه سوسپانسـیون بـاکتری همراه با بیمارگر بوده درمقایسـه بـا کنتـرل منفـی (قـارچ بیمـارگر) و کنترل مثبت (شاهد سالم) اختلاف معنیدار وجود دارد. تجزیه واریانس ارتفاع اندام هوایی و طول ریشه گندم به ترتیب در جدول-2 و-3 آمده است.
