بخشی از مقاله
واکنش ارقام هسته دارها به فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام
چکیده
جاروک یکی از بیماریهای مهم بادام در ایران و لبنان است. عامل این بیماری Candidatus Phytoplasma phoenicium و متعلق به گروه جاروک نخود کبوتر (16SrIX) میباشد. جهت مطالعه واکنش هستهدارها نسبت به این فیتوپلاسما، نهالهای دو ساله ارقام درختان میوه هستهدار با روش پیوند جانبی با این فیتوپلاسما مایهزنی شدند. دو سال بعد از مایهزنی، در آلبالو (رقم شاتن مورل)، آلو (ارقام سانتاروزا و شایرو)، زردآلو (ارقام آصفی و تلخ)، شلیل رقم قرمز، گوجه سبز (ارقام سعدی و برغان) و هلو (ارقام زعفران ی، البرتا و شفتالو) در مقایسه با شاهد، علایمی شامل زردی، ریز برگی، لولهای شدن برگها، کاهش فاصله میانگرهها، کوتولگی و جاروک ظاهر شد. دوره نهفتگی عامل بیماری در گیاهان مایهزنی شده از پنج تا نه ماه متغیر بود. میزان رشد پیوندک آلوده در گیاهان مایهزنی شده با شدت علائم ناشی از انتقال عامل جاروک بادام رابطه مستقیم ول ی با مدت دوره نهفتگی بیماری در گ یاه رابطه معکوس داشت. دی. ان. ای کل استخراج شده از رگبرگ میانی گیاهان مایهزنی شده و گیاهان سالم شاهد به وسیله آزمون PCR مستقیم با استفاده از جفت آغازگر P1/P7 و PCR دومرحلهای با استفاده از جفت آغازگرهای P1/P7 و R16F2n/R16R2 از نظر آلودگی به فیتوپلاسما ارزیابی گردیدند و واکنش همه هستهدارهای مایهزنی شده علائمدار در این آزمونها مثبت بود. در آزمونPCR دو مرحلهای علاوه بر ارقام علائم دار، واکنش نمونههای گیلاس مشکی مشهد و گوجه سبز هلندی که تا دو سال بعد از مایهزنی فاقد علائم بودند، نیز مثبت بود و در آنها قطعه ۰۰۲۱ جفت بازی تکثیر شد. تا دو سال بعد از مایهزنی در آلبالو رقم چمپای مشهد، زردآلو ارقام شکرپاره، تخم مرغی، نوری و گیلاس رقم صورتی لواسانات هیچگونه علایمی ظاهر نشد و واکنش آنها در مقابل آزمون PCR منفی بود. پیشتر حساسیت هلو و شلیل به فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام گزارش شده بود ولی آلودگی شفتالو، آلو، گوجه سبز، زردآلو، گیلاس و آلبالو به فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام برای اولین بار گزارش میشود.
واﮊههای کلیدی: فیتوپلاسما، جاروک بادام، هستهدارها، واکنش ارقام
مقدمه
براساس علائم بیماری، انتقال با پیوند و درمان موقت با آنتیبیوتیک اکسی تتراسیکلین، جاروک بادام (Prunus amygdalus Batsch) به عنوان یک بیماری فیتوپلاسمایی و مهم برای اولین بار در سال ۴۷۳۱ از مناطق خفر و میمند در استان فارس ( Salehi & (Izadpanah 1995 سپس طی سالهای ۴۸۳۱-۰۸۳۱ از استانهای چهارمحال و بختیاری (شهرکرد)، اصفهان (شهرضا) و کرمان (بافت) گزارش شد .(Salehi et al. 2006) در سال ۱۰۰۲ بیماری مشابهی در درختان بادام از منطقه بکا در کشور لبنان گزارش گردید .(Choueiri et al. 2001, Abou-Jawdah et al. 2002)
بر اساس آنالیز چند شکلی طول قطعات برشی (RFLP) و تعیین ترادف ﮊن 16S rRNA فیتوپلاسمای عامل بیماری جاروک بادام در لبنان و ایران متعلق به گروه جاروک نخود کبوتر (Pigeon pea witches' broom) یا گروه ار.ان.ای ریبوزومی 16SrIX زیر گروه 16SrIX-A میباشد ( Abou-Jawdah et al. 2002, Verdin et al. .(2003 همین آنالیزها نشان داد که فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام در لبنان با سایر اعضای گروه نخود کبوتر، سایر فیتوپلاسماهای عامل بیماری در هستهدارها و دیگر درختان میوه متفاوت میباشد و تنها با فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام در ایران شباهت بسیار زیادی دارد. به دلیل این خصوصیات ویژه نام Candidatus Phytoplasma phoenicium برای این فیتوپلاسما برگزیده شد ( Verdin .( et al. 2003
مطالعه ویژگیهای بیولوﮊیکی و مولکولی نشان داد که فیتوپلاسماهای عامل بیماری جاروک بادام در مناطق نیریز و خفر (استان فارس) یکسان نیستند و فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام در نیریز نسبت به جدایه خفر شباهت بیشتری به فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام در لبنان دارد .(Salehi et al. 2006) جاروک بادام وحشی( (Spach) C. (P. scopari K. Schneid نیز در مناطق میمند، کوار،فیروزآباد (استان فارس) و سرچهان (استان یزد) مشاهده گردید. آنالیزهای مولکولی فاصله بین ﮊنهای 16S rRNA و (Spacer region, SR ) 23S rRNA نشا ن داد که فیتوپلاسمای جاروک بادام وحشی کوار متعلق به گروه جاروک نخود کبوتر است و در بین اعضای این گروه رابطه بسیار نزدیکی با فیتوپلاسماهای همراه با جاروک بادام لبنان (Ca. Phytoplasma phoenicium) و جاروک بادام نیریز در ایران دارد .(Salehi et al. 2006) در ایران در مناطق بادام خیز و آلوده به فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام گونههای مختلف درختان میوه هستهدار نیز کشت میشوند که ارزیابی آنها از نظر حساسیت و مقاومت به این فیتوپلاسما ضروری است و تحقیق حاضر در همین راستا انجام شد.
روش بررسی
جهت مطالعه واکنش هستهدارها به فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام، نهالهای دو ساله درختان میوه هستهدار شامل آلبالو (Prunus cerasus L.) ارقام چمپای مشهد و شاتن مورل، آلو (P. salicina L.) ارقام سانتاروزا و شایرو، زردآلو (P. armeniaca L.) ارقام آصفی، تخم مرغی، شکرپاره، تلخ و نوری، گوجه سبز ( ارقام سعدی ارومیه، برغان و هلندی، گیلاس (P. avium L.) ارقام صورتی لواسانات و مشکی مشهد، شلیل(.(P. persica var. nusipersica L رقم قرمز و هلو (P. persica(L.) Batsch. ) ارقام زعفرانی، البرتا و شفتالو از یک نهالستان در اصفهان خریداری و پس از نشا در گلدانهای مناسب به یک گلخانه عاری از حشرات در مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی فارس انتقال داده شدند. نهالهای بادام تلخ مورد نیاز از طریق بذر در گلخانه تکثیر شدند. دمای گلخانه در طول مدت این مطالعه از °C۸۱ تا °C۰۳ متغیر بود. شدت نورگیری با به کارگیری سایبانهای حصیری و لامپهای فلورسنت (بسته به شرایط) تا حدودی تنظیم شد. کلیه نهالهای خریداری شده با استفاده از آزمون PCR قبل و بعد از مایهزنی با عامل جاروک بادام از نظر آلودگی به فیتوپلاسما بررسی شدند. پس از اطمینان از عدم آلودگی به فیتوپلاسما که در آزمون PCR حاصل شد، در اردیبهشت ماه نهالهای هستهدار با روش پیوند جانبی با عامل جاروک بادام مایهزنی گردیدند. از سرشاخههای ظریف و کوچک یک نهال بادام آلوده به فیتوپلاسمای عامل جاروک بادام (جدایه خفر) که دارای دو تا سه برگ بود به عنوان پیوندک و از نهالهای سالم درختان میوه هستهدار موجود در گلخانه به عنوان پایه استفاده شد. برای هر رقم پنج نهال به عنوان پایه انتخاب و روی هرکدام سه پیوندک آلوده به بیماری جاروک پیوند و یک نهال از هر رقم نیز به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. پنج نهال بادام تلخ بذری با پیوندک آلوده مایهزنی و به عنوان کنترل مثبت در گلخانه نگهداری شدند.
موضع پیوند به وسیله پارافیلم بسته و ناحیه پیوند شده به وسیله یک کیسه نایلونی شفاف پوشانده شد. جهت حصول اطمینان از گرفتن پیوندکها کیسههای نایلونی در همین وضعیت به مدت سه هفته نگهداری شدند. آلودگی جاروکها یا شاخههای حاصل از رشد پیوندکها به فیتوپلاسما با آزمون PCR بررسی گردید. گیاهان مایهزنی شده تا دوسال از نظر ظهور علائم احتمالی بیماری در یک گلخانه عاری از حشرات تحت نظر قرار گرفتند.
در نهالهای مورد آزمایش از ۲/۰ گرم بافت رگبرگ میانی یا دمبرگ به روش ﮊانگ و همکاران( Zhang et al. (1998 با اندکی تغییرات (Abou-Jawdah et al. 2002) دی.ان.ای کل استخراج گردید. بعد از خشک شدن رسوب نهایی در دمای اتاق، ۰۵ میکرولیتر آب دو بار تقطیر سترون به آن اضافه و در دمای °C۰۲- نگهداری شد تا از آن به عنوان دی. ان. ای الگو در آزمایشهای PCR استفاده شود. آزمون PCR مستقیم با استفاده از جفت آغازگر عمومی (Schneider et al. 1995) P1/P7 و PCR دو مرحلهای با استفاده از جفت آغازگرهای P1/P7 در دور اول و (Gundersen & Lee 1996 ) R16F2n / R16R2 در دور دوم انجام شد. جفت آغازگر اندازه تقریبی۰۰۸۱ جفت باز شامل ﮊن 16S rRNA و ناحیه بین ﮊنهای 16S rRNA و23S rRNA و ابتدای ﮊن 23S rRNA و جفت آغازگر R16F2n/R16R2 یک قطعه از ﮊن 16S rRNA با اندازه تقریبی ۰۰۲۱ جفت باز را تکثیر میکند. حجم نهایی مخلوط واکنش PCR، ۵۱ میکرولیتر و شامل دو میکرولیتر (۰۵ نانوگرم) دی.ان.ای الگو، ۵/۰ میکرولیتر از هر آغازگر با غلظت پایه ۵/۰ میکرومولار، ۵۳/۰ میکرولیتر از مخلوط نوکلئوتیدی (dNTP) با غلظت پایه ۰۱ میلی مولار، ۵/۱ میکرولیتر بافر ۰۱ برابر و ۲/۰ میکرولیتر از آنزیم پلیمراز (ساخت شرکت سیناﮊن ایران) با غلظت پایه پنج واحد در یک میکرولیتر بود که با افزودن آب مقطر دو بار تقطیر سترون حجم آن به ۵۱ میکرولیتر رسانده شد. برای جلوگیری از تبخیر، حدود ۳۱ میکرولیتر روغن معدنی Sigma No. 232-) (455-8 به هر لوله محتوی مخلوط واکنش اضافه و سپس لولهها در دستگاه ترموسایکلر BIORAD قرار داده شدند.
چرخه دمایی PCR عبارت بود از یک برنامه یک چرخهای شامل دمای °C۴۹ به مدت دو دقیقه و یک برنامه ۵۳ چرخهای شامل دمای °C۴۹ در یک دقیقه، دمای °C ۵۵ به مدت دو دقیقه و °C ۲۷ به مدت سه دقیقه. چرخه نهایی در دمای °C ۲۷ به مدت ۰۱ دقیقه بود. در آزمون PCR دو مرحلهای، ابتدا محصول PCR مستقیم با استفاده از آب دوبار تقطیر سترون به نسبت ۰۳:۱ رقیق گردید و از آن به عنوان دی. ان. ای الگو استفاده شد. شرایط PCR دو مرحلهای مانند شرایط PCR مستقیم بود. محصول PCR حاصل از هر دو آزمون در ﮊل آگاروز ۲/۱ درصد الکتروفورز و از نوارهای دی. ان. ای عکس تهیه شد. محصول PCR آشیانهای (حدود ۰۰۲۱جفت باز) مربوط به هر نمونه به طور جداگانه با آنزیمهای AluI ، Hinf I و RsaI هضم شد. محلول پایه برای هر واکنش ۰۲ میکرولیتر تنظیم گردید. برای برش با هر آنزیم، ۵۱/۰ میکرولیتر از آن آنزیم به همراه دو میکرولیتر بافر آنزیم و ۵۸/۹ میکرولیتر آب دو بار تقطیر سترون به هشت میکرولیتر محصول PCR اضافه و سپس به مدت چهار ساعت در دستگاه ترموبلاک با دمای °C ۷۳ قرار داده شد.
محصول هضم آنزیمی با آنزیمهای مختلف در ﮊل آگارز دو درصد الکتروفورز و از نوارهای دی. ان. ای عکسبرداری گردید.
