بخشی از مقاله
چکیده
توس دارای ویژگی های ممتاز دارویی - ضد سرطان قوی و موثر در درمان ایدز و هپاتیت - میباشد . در حال حاضر پراکنش محدود توس در ایران باعث شده است که این درخت به عنوان یک گونه در معرض انقراض محسوب شود. هدف از این مطالعه بررسی تنوع و ساختار ژنتیکی این گونه در چهار رویشگاه اصلی آن در ایران - سیاه مرز کوه، سنگنده، شهرستانک و مارمیشو - میباشد. در این مطالعه از 13 نشانگر SSR شامل L1.10 ، L2.2، L2.7، L3.1، L3.4، L4.4، L5.4، L5.5، L7.1، L7.3، L7.4، L7.8 و L022 برای مطالعه تنوع ژنتیکی استفاده شد.
میانگین شاخص شانون در لوکوس های SSR در این مطالعه 1.25 محاسبه شد که از 0.92 در مارکر L5.5 تا 1.64 در مارکر L2.7 تغییر کرد. مقایسه شاخص های تنوع بین جمعیت ها نشان داد که کمترین مقدار تعداد الل موثر، شاخص شانون و هتروزیگوسی مورد انتظار متعلق به جمعیت شهرستانک بود. میانگین شاخص تثبیت - FST - در این مطالعه 0/32 بود که نشان دهنده تمایز ژنتیکی بین جمعیتهای مورد مطالعه است. زیادبود هتروزیگوسی در دو جمعیت شهرستانک و مارمیشو مشاهده شد، که میتواند نشان دهنده وجود تنگنای ژنتیکی باشد.
مقدمه
درخت توس - Betula pendula Roth - گیاهی است تک پایه، دگره افشان و دیپلوئید - 2n=2x=28 - که اندازه تقریبی ژنوم آن 400 Mb می باشد . - Atkinson 1992 - این گونه دارای خواص ممتاز دارویی - ضد سرطان قوی و موثر در درمان ایدز و هپاتیت - بوده - Zyryanova 2010 - و همچنین دارای چوب بسیار با ارزش برای صنایع مختلف می باشد. از اهداف زیربنایی سازمان جنگلها، مراتع و آبخیزداری ایران تحقیق در گزینش بهترین روش احیاء و توسعه جنگل در ارتفاعات باالبند شمال متصل به مراتع کوهستانی است که یقینا موفقیت چنین برنامه های دراز مدتی مستلزم شناخت کافی از ساختار تنوع ژنتیکی ژرم پالسم موجود است .
به طور کلی از نظر مدیریتی حفظ جمعیت های جنگلی به صورت پایدار، نیازمند دریافت اطالعات مستمر در زمینه میزان تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتها است . - Thormann et al. 1994 - در جمعیتی که جدا و کوچک مانده باشد - مانند درختان توس ایران - ، احتمال بوجود آمدن تنگنای ژنتیکی وجود دارد که بررسی و شناسایی آنها حائز اهمیت است - Lowe et ..al. 2005 - پدیده تنگنای ژنتیکی میتواند باعث کاهش اندازه موثر جمعیت و در نتیجه کاهش تنوع ژنتیکی جمعیتها شود .
- Freeland 2005 - در طی سال های اخیر پژوهشگران بسیاری در مناطق مختلف دنیا تنوع درختان جنگلی را با استفاده از مارکر های SSR بررسی کرده اند: تعیین میزان تنوع ژنتیکی در 12 جمعیت Fraxinus excelsior برای درك علت وجود تفاوت معنی دار بین هتروزیگوسیتی مشاهده شده و هتروزیگوسیتی مورد انتظار - Morand et al 2002 - ، ساختار ژنتیکی 13 جمعیت Pinus sylvestris در مناطق مدیترانه ای - Robledo Arnuncio et al. 2005 - ، تمایز ژنتیکی در بین نسل های مختلف درخت راش در جنگلهای خزری - Salehi Shanjani and Vendramin 2007 - ، تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتی در شش جمعیت از درخت نادر Sorbus torminalis در جنگلهای اروپا - Rasmussen and Kollmann 2008 - ، تنوع ژنتیکی چهار جمعیت - Quercus branti - در جنگلهای غرب ایران - Zolfaghari et al. 2009 - تنوع ژنتیکی درخت در معرض انقراض - - Dalbergia monticola در جنگلهای ماداگاسکار - Andrianoelina et al. 2009 - و ساختار ژنتیکی 16 جمعیت - Betula maximowicziana - در جنگلهای چی چیبو ژاپن . - Tsuda et al. 2010 - گونه توس در ایران در مناطق صعب العبور با آب و هوای نامساعد رویش دارد. متاسفانه رویشگاه های توس در ایران نادر و در معرض انقراض - Jalil and Jamzad 1999 - بوده و اطالعاتی درباره تنوع و ساختار ژنتیکی این گونه وجود ندارد. هدف از این تحقیق بررسی تنوع و ساختار ژنتیکی این گونه در رویشگاههای مهم آن در ایران بود که اطالعات حاصله می تواند در راستای برنامه های حفاظت از این گونه ارزشمند استفاده ارائه شود.
مواد و روش ها
مواد گیاهی
در اوایل بهار از چهار رویشگاه اصلی توس در ایران - شکل - 1، از هر رویشگاه 10 درخت، در مجموع 40 درخت به طور تصادفی انتخاب و از برگها نمونه گیری انجام شد - جدول . - 1 نمونه ها تا زمان استخراج DNA در یخچال منفی80 نگهداری شدند.
استخراج DNA و واکنش های PCR
در این تحقیق از 13 پرایمر SSR معرفی شده توسط Kulju et al. - 2003 - استفاده شد - جدول . - 2 در ضمن، مارکر L3.1 به دلیل عدم تکثیر در آنالیزها استفاده نشد. واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 100 نانوگرم DNA الگو، 200 میکروموالر dNTPs، 0.4 میکروموالر از هر پرایمر ، دو میلی موالر کلرید منیزیم، بافر PCR - یک برابر - و یک واحد آنزیم Taq که در نهایت حجم نهایی با استفاده از آب دو بار تقطیر به25 میکرولیتر رسانده شد.
برنامه حرارتی به صورت Touchdown طراحی شد. به طوری که مرحله اول شامل سه دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد برای واسرشته شدن اولیه DNA الگو، مرحله دوم شامل 10 چرخه که هر کدام شامل 30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، 30 ثانیه در 65 درجه سانتیگراد برای اتصال پرایمر ها و یک دقیقه در 72 درجه سانتیگراد برای بسط پرایمر ها بود. مرحله سوم شامل 26 چرخه، که هر کدام شامل 30 ثانیه دمای 94، 30 ثانیه دمای اتصال مناسب برای هر پرایمر - جدول - 2 و یک دقیقه 72 درجه سانتیگراد بود. مرحله 4 یا بسط نهایی نیز شامل 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد بود. پس از اتمام واکنش PCR جهت تفکیک قطعات تکثیر شده از الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید هشت درصد بدون اوره استفاده و رنگ آمیزی با استفاده از اتیدیوم بروماید انجام شد.
