بخشی از مقاله
کلونینگ و بیان سابیونیت P28 اینترلوکین ٍْ27 انسانی
چکیده
اینترلوکینٍْ IL-27) )یک سایتوکاین جدید است که یکی از اعضای مشترک از خانواده های اینترلوکین ٌٍو ٍَ به حساب می آید
و به وسیله سلول های عرضه کننده آنتی ژن ترشح میشود. هترو دایمری شامل دو سابیونیت P28 و (EBI3)Epstein-Barr-induced gene 3 است. مطالعات اخیر ظرفیت های جدیدی را برایIL-27 از جمله تحریک خون سازی،افزایش بروز آنتی بادی یه وسیله سلول های نمایش دهنده آنتی بادی (APCS)، سرکوب رگزایی در تومور های والد و متاستاز ها، سرکوب همانند سازی HIV تشخیص داده است. از آنجا که IL-27 از عوامل ضد التهاب است وتعداد لنفوسیت های TH17 را کم و بیان IL-17 را مهار میکند، به نظر میرسد میتواند به عنوان یک پتانسیل درمانی بر علیه بیماری های خود ایمنی معرفی شود و در درمان multiple sclerosis وarthritis rheumatoid، ایدز و سرطان به عنوان دارو استفاده شود.
مواد و روش ها: توالی نوکلئوتیدی ژن p28 سابیونیت تشکیل دهده اینتر لوکین ٍْ در وکتور پلاسمیدی سفارش داده شد. جهت کلون مجدد در وکتور بیانی ˛پلاسمید های حاوی ژن با پرایمر های دارای جایگاه اثربرای آنزیمهای BamH1 و Sac1،PCR شد ودر وکتورpet Duet1 کلون گردید. p28نوترکیب با القای IPTG در سلول بیانی باکتریایی بیان شد.در نهایت تایید بیان پروتئین با Western Blot صورت گرفت.
نتیجه و بحث: p28در وکتور مورد نظر کلون شد و پروتئین بیان شده هم بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده شد و توسط آنتی بادی His Tag با وسترن بلاتینگ تایید گردید.
کلمات کلیدی:اینترلوکین ٍْ--p28 کلونینگ- بیماریهای اتوایمیون.
مقدمه
سایتوکاین ها که اینترلوکین ها نیز شامل آنها میشوند نقش اصلی را در القا و محدود کردن التهاب دارند. از وظایف آنها میتوان به: ٌ-ایجاد تعادل موضعی بین سایتوکاین های ویژه و لنفوسیت های T CD4+ 2ٍ- تنظیم کننده های کلیدی پاسخ های التهابی
َ3- تمایز بین چند فنوتیپ ویژه در T H1,TH 2و TH17 که در زیر مجموعه های تنظیم کننده قرار دارند ،اشاره نمود(ٌ1) .
IL-27 اساسا در تمایز لنفوسیت های TH1، افزایش پاسخ های ایمنی نوع سلولی و کاهش متقابل واکنش های ایمنی خونی TH2 ارتباط پیدا میکند. اخیرا یافت شده است که IL-27 همچنین ممکن است بر سلول های دیگر شامل لنفوسیت های TH17و لنفوسیت های B و سلولهای NK نیز اثر داشته باشد (ٍ). و نیز این پروتئین نقش مهمی در هماهنگی بین برخی ازمکانیسم های ایمنی ایفا می کند. یافته های آینده در مورد عملکرد IL-27 نقش این سایتوکاین را دربسیاری از رفتار های شیمیایی به طور خاص در سرطان ، آرترید روماتویید ، MS معرفی می نماید (َ) .
در مقایسه با سایر سایتوکاین های خانواده IL-12 ،IL-27 این تفاوت را دارد که سابیونیت هایش فاقد پیوند کوالانسی می باشند.
عدم وجود پیوند های دی سولفید این اجازه را از نظر تئوری میدهد که دو سابیونیت به وسیله سلولهای جداگانه تولید شوند و به دنبال آن در ساختار خارج سلولی به هم ملحق شوند (ُ) بنابراین با توجه به اهمیت بالای IL-27، احتمال در آینده نقش مهمی را در درمان بسیاری از بیماری ها ایفا خواهد نمود. (ٌ). IL-27 در مهار آنژیوژنز نه تنها در تومورهای والدی بلکه در متاستازها دخالت دارد و میزان آنها را تا َُ درصد کاهش میدهد. همچنین میتواند رشد تصاعدی تومور را با مکانیسم های مختلف به طور همزمان مهار کرده و رشد تومورهای متاستاتیک و اولیه را سرکوب کند و به عنوان یک ماده کمکی در درمان بسیاری از تومورهای سخت وپیشرفته مفید باشد (ٌ).
مواد و روش ها
کلونینگ: توالی ژن P28 که یکی از سابیونیتهای تشکیل دهنده ی اینتر لوکینٍْاست از بانک ژنی استخراج و در پلاسمیدpGH سنتز شد. به منظور ایجاد جایگاه آنزیمی در دو طرف ژنهای ساخته شده پرایمر هایی طراحی و ساخته شد که دارای جایگاه آنزیم های محدود کننده ی مورد نظر باشند. بدین ترتیب که پس از انجام واکنش PCR محصول به دست آمده توالی 733bpژن P28 بوده که در دو طرف توالی دارای جایگاه اثربرای آنزیم های BamH1و Sac1 میباشد که با همین جایگاه های آنزیمی در وکتور pET Duet1 کلون شد. به این ترتیب که وکتور مورد نظر با آنزیم های دوطرف قطعه بریده شده و به عنوان وکتور خطی وقطعه تکثیر شده پس از انکوباسیون با آنزیم های دو سر قطعه به عنوان Insert در واکنش لایگیشن استفاده شد.
ترنسفرماسیون محصول واکنش لایگیشن در باکتری XL1Blue انجام وروی محیط حاوی آمپی سیلین ،کشت داده شد.پس از استخراج پلاسمید کلونی های به دست آمده حضور قطعه P28 با پرایمر های اختصاصی
(5’ACCGGTGGAGCTCATCAGGGCTGGGGGCTC3’:R) و((5’GTACCGCGGATCCATGGGCCAGACGGCAGGC3’:F تائید شد.
بیان پروتئین: پلاسمید هایpET Duet1 حاوی ژن در سلول بیانیBL21 ترنسفورم شد و سپس در محیط مایع با غلظت IPTG(1mM) در دمای َْ درجه القاشد.پس از جمع آوری رسوب باکتری در ساعات مختلف و انجام استخراج پروتئین از باکتری ،الکتروفورز پروتئین های هر کدام از نمونه ها در مقایسه باپروتئین های باکتری بدون قطعه کلون شده ، روی ژلٌِ% SDS-PAGE انجام شد .برای تائید حضور پروتئین بیان شده در باکتری تست Western Blot انجام گردید. بدین صورت که پس از انجام الکتروفورز پروتئین ها و انتقال آنها به غشاء نیترو سلولوزی باند پروتئین به کمک آنتی بادی کونژوگه اختصاصی بر علیه - His Tag که در ابتدای ژن کلون شده قرار دارد ،رویت شد.
