بخشی از مقاله
مقدمه
ریشه گیاهان بدلیل ارتباط مستقیم با خاك بیشترین تأثیرپذیري را از محیط و محتواي خاك دارد. در صورت وجود هر نوع شرایط نامطلوب خاك اعم از شوري، خشکی، شرایط غرقابی و وجود آلایندهها و سموم در خاك، ریشه در دسترسترین اندام گیاه براي آسیبپذیري و واکنش در برابر این تنشهاست. در خاکهاي آلوده پاسخ ریشه گیاهان در مقابله با سموم یا آلایندهها شامل حذف، تجزیه و غیرفعال سازي آنهاست.
گیاهان آلایندهها را از طریق ریشه خود جذب نموده و بعد طی فرایندهایی آن را ذخیره (Phytoextraction) یا تجزیه
(Phytodegradation) میکنند .(28)
در خاکهاي آلوده به مواد آلی شیمیایی گیاهان اثرات گیاه پالایی (Phytoremediation) خود را بر روي آلایندهها، با تحریک میکروارگانیسمهاي ریزوسفر جهت تجزیه این سموم اعمال میکنند که به آن فرایند Rhizodegradation
میگویند (گیاهان جمعیت میکربهاي محیط ریشه را با ترشحات کربنی، آنزیمی، مواد مغذي، انرژي و گاهی اوقات اکسیژن تحریک و حمایت میکنند) 5)، 8 و.(26
نوع ترشحات ریشه گیاهان میتواند بر نوع برهمکنش گیاهان و میکروارگانیسمهاي خاك تأثیر بگذارد. این برهمکنشها با توجه به نوع ترشحات، میتواند اختصاصی یا غیر اختصاصی باشد .(23)
500
مجله پژوهشهاي گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
برهمکنشهاي اختصاصی زمانی روي میدهد که ترشحات ریشه گیاهان یک ترکیب شیمیایی خاص را در پاسخ به حضور نوعی آلاینده ترشح کنند .(27) در برهمکنشهاي غیر اختصاصی مواد شیمیایی مشابهی از ریشه گیاهان در پاسخ به انواع آلایندهها ترشح میشوند.
آلایندههاي نفتی نیز ازجمله ترکیباتی هستند که گیاهان آن را با کمک میکربها و یا پس از جذب بطور مستقیم تجزیه میکنند 10)و .(13 گیاهان بسیاري بهعنوان گیاهان مقاوم به آلودگی نفتی توسط محققان مختلف شناسایی و معرفی شدهاند .(12) از اولین علائم مسمومیت ناشی از هیدروکربنهاي نفت خام بر روي گیاهان کاهش رشد است
6) و.(21
میزان تحمل به ترکیبات نفت خام در گیاهان مختلف متفاوت است. اگر سطح آلودگی نفتی خاك در حد تحمل گیاه باشد، گیاه میتواند بخوبی رشد کند، بدون اینکه علائم آسیب در آن نمایان گردد. در سال 1994، دیوید و همکاران با بررسی یونجه در خاکهاي آلوده به تولوئن دریافتند که یونجه به مدت یکسال در خاکی با غلظت ppm
500 تولوئن که از رطوبت اشباع باشد، فعالانه رشد میکند. زمانیکه سطع آلودگی خاك در حد بحرانی باشد، علائم آسیب در گیاهان نمایان میگردد. دانهرستهاي ذرت با افزایش غلظت نفت خام تا حد %10 v/w در خاك، علائمی ازجمله زردي برگ، تشکیل نقاط بافت مردگی در برگها، کمبود آب و توقف رشد را نشان میدهند .(25) از اولین علائم آسیب ریشه گیاهان در غلظتهاي بحرانی هیدروکربنهاي نفت خام کاهش بیوماس ریشه و تغییر ساختمان ریشه در برخی گونههاست که در مطالعات بسیاري از محققان گزارش شده است 17)و.(29
هیدروکربنها قادرند ریشه گیاهان را بپوشانند و مانع دسترسی ریشه به آب و مواد مغذي گردند .(15) این مسئله منجر به کاهش رشد و تولیدات ریشه میگردد و بر قابلیت ترشح ریشه نیز تأثیرگذار است.
آنچه مسلم است اینکه ریشه گیاهان بدلیل تماس مستقیم با ترکیبات نفتی در مقایسه با سایر اندامهاي گیاه تأثیر بیشتري بر روي آلاینده و میکروارگانیسمهاي خاك دارد و از طرف دیگر خود نیز از نظر عملکرد، رشد و ساختار تغییرات بیشتري را متحمل میشود. میزان آسیبپذیري ریشه و نحوه عملکرد آن نه تنها تعیین کننده دوام و پایداري گیاه در شرایط آلوده است بلکه کارایی گیاه را در پروسه گیاه پالایی کاملا تحت تأثیر قرار می دهد.
در این مطالعه تغییرات و عملکرد ریشه برخی گیاهان در خاکهاي آلوده به پسابهاي نفتی مورد بررسی قرار گرفت.
از سه گیاه ذرت (Zea mays)، جودوسر (Avena sativa) و
آفتابگردان (Helianthus annus) در این پژوهش استفاده شد. این گیاهان داراي پتانسیل قابل توجهی در تحمل محیطهاي آلوده به نفت میباشند و از آنها در بسیاري از مطالعات گیاه پالایی ترکیبات نفتی استفاده شده است 6)
و.(20 لازم به ذکر است که جودوسر از گیاهان بومی اطراف پالایشگاه تهران است. در این مطالعه از خاکهاي آلوده پوند 4 پالایشگاه تهران استفاده شد که قدمت آلودگی نفتی آن بالغ بر 50 سال بود. پس از انجام نمونهبرداري و تعیین میزان کل ترکیبات نفتی خاك، بذر گیاهان در خاکهاي آلوده و غیرآلوده، درون گلدان کشت شد. 4 هفته پس از جوانه زنی، رشد ریشه و غلظت کل پروتئینهاي ریشه اندازهگیري شد. پس از 8 هفته جمعیت میکربی محیط ریشه گیاهان و تغییرات آناتومیک بافتهاي ریشه بررسی گردید.
مواد و روشها
نمونهبرداري و آماده سازي خاك: در منطقه آلوده، آلودگی به شکل لکههایی در سطح خاك نمایان بود و خاك از نظر آلودگی همگن نبود. نمونهبرداري در دو محل و از دو عمق خاك آلوده صورت گرفت. در محل اول، نمونهبرداري تا عمق 50 سانتیمتري از سطح خاك انجام شد. ترکیبات نفتی این خاك به رنگ قهوهاي تیره، چسبناك
501
مجله پژوهشهاي گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
و بشدت آبگریز بود و خواص ظاهري آن به ترکیبات نفتی سنگین یا سوختهاي دیزلی نزدیک بود. در محل دوم، نمونهبرداري در عمق 50 تا 100 سانتیمتري سطح خاك انجام شد. ترکیبات نفتی خاك در این عمق شفاف و زرد رنگ، با ویسکوزیته اندك و خواص آبگریزي میانهاي بود.
همچنین از یک ناحیه غیرآلوده این منطقه بهعنوان خاك شاهد تا عمق 50 سانتیمتري از سطح خاك نمونهبرداري شد. خاکهاي آلوده پس از انتقال به آزمایشگاه در شرایط هوا خشک شدند و بعد با غربالهاي 2 میلیمتري الک شدند تا ذرات آلاینده بطور یکنواخت در بافت خاك پخش شود، سپس خاکهاي آلوده محل اول و دوم به نسبت
1 به 1 با هم مخلوط شدند. این خاك جهت کشت و مطالعه گیاهان مورد استفاده قرار گرفت.
تعیین میزان ترکیبات نفتی خاك: 5 گرم خاك پس از توزین به درون یک بالن 100 میلی لیتري ریخته شد و ترکیبات نفتی موجود در آن با استفاده از گزیلن به مقدار
mL 50 در چند مرحله استخراج شدند. در هر بار گزیلن
mL10 به خاك اضافه شد و مخلوط حاصل با دور شدید شیکر شد. سپس محلولهاي استخراجی به لولههاي سانتریفوژ منتقل گردیدند. لولهها بمدت 15 دقیقه و با سرعت 67g در دستگاه سانتریفوژ مدل Beckman
سانتریفوژ شدند. جذب روشناور حاصل از سانتریفوژ ترکیبات نفتی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر UV-visible مدل Philips در طول موج 425 نانومتر بررسی شد. بهمنظور رسم منحنی استاندارد از غلظتهاي 1 تا 8 ppm نفت کرایزن استفاده شد .(18)
تهیه بذر و روش کشت: بذرهاي رقم SC700 ذرت و همچنین رقم آذر گل آفتابگردان از مؤسسه اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شدند. بذر علف جودوسر از ذخایر موجود در آزمایشگاه گیاهشناسی دانشگاه الزهرا تهیه شد.
ابتدا بذر گیاهان از نظر قوه نامیه بررسی شدند. سپس
بذرها در گلدان و در دو نوع تیمار خاك آلوده و شاهد کشت شدند. آبیاري در حد ظرفیت زراعی انجام شد.
بررسی رشد و تغییرات ریشه: چهار هفته پس از جوانهزنی، جهت بررسی ریشه ابتدا گیاه (چهار نمونه از هر نوع گیاه) را با احتیاط از گلدان خارج کرده، بطوریکه ریشه گیاه آسیب نبیند و پاره نشود. سپس گیاه با آب شستشو داده شد تا کلیه ذرات خاك از ریشه شسته شود. ریشه گیاهان از نظر رشد طولی ارزیابی و محاسبه شدند.
سنجش پروتئین : با جدا کردن ریشه از گیاهان، نمونههاي ریشهاي جهت استخراج پروتئین از ریشه بدست آمدند.
نسبت بافر استخراج به نمونه 1 به 2 بود. به این منظور از بافر فسفات سدیم 0/2 مولار (pH=7/5) استفاده شد.
استخراج پروتئین درهاون چینی و تمامی مراحل در سردخانه و در دماي 4-0 درجه سانتیگراد انجام شد. به این منظور پس از افزودن بافر استخراج، عمل سائیدن در هاون بمدت 30 دقیقه ادامه یافت تا اینکه نمونهها همگن شدند.
سپس همگناي حاصل به لوله سانتریفوژ منتقل شد و با استفاده از دستگاه سانتریفوژ مدل (LE80K) Beckman در دماي 4 درجه سانتیگراد با سرعت 11326g بمدت 45
دقیقه سانتریفوژ شد. پس از پایان سانتریفوژ محلول روشناور از6 لایه پارچه ململ عبور داده شد. سپس سنجش پروتئین به روش برادفورد (1976) انجام شد و به منظور تهیه محلول استاندارد از غلظتهاي مختلف سرم آلبومین گاوي استفاده شد. سري غلظتهاي محلول استاندارد 40/5،50،5،2،0،10،15،20،25،30 میلیگرم بر میلی لیتر بدست آمدند. جذب هر نمونه پس از 15 دقیقه بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر UV-visible مدل Philips
در طول موج 595 نانومتر قرائت شد.
تعیین جمعیت میکربهاي خاك : هشت هفته پس از جوانهزنی جمعیت میکربهاي محیط ریشه تعیین شد.
تعدادي گلدان حاوي خاك آلوده و فاقد گیاه بهعنوان شاهد در همان شرایط محیطی گلدانهاي حاوي گیاه بمدت هشت
502
مجله پژوهشهاي گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
هفته آبیاري شدند تا جمعیت میکربهاي خاك صرفنظر از اثرات تحریک کنندگی ریشه گیاهان تعیین گردد. به یک گرم خاك محیط ریشه هر تیمار، آب مقطر استریل به میزان
mL 9 اضافه شد و به مدت 5 دقیقه شیکر شد تا میکربهاي چسبیده به ذرات خاك جدا شوند. از روشناور بالاي رسوب، رقتهاي 10-1، 10 -2،10 -3،10 -4،10 -5،10 -6و-7
10 در آب مقطر استریل تهیه گردید.
کشت میکربهاي هوازي: یک میلی لیتر از سوسپانسیون میکربی رقیق نشده و از هر رقت 1 میلی لیتر در پلیتهاي استریل ریخته شد و بعد mL 20 -15 محیط کشت حاوي آگار با دماي 50- 45 درجه سانتی گراد به هر پلیت اضافه شد. پس از منعقد شدن آگار پلیتها در حرارت 30-25
درجه سانتی گراد بمدت 72-48 ساعت انکوبه شدند.
کشت میکربهاي بی هوازي: 5 میلی لیتر محیط کشت حاوي آگار (nutrient agar) در پلیت استریل 8 میلی لیتري ریخته شد، بعد از منعقد شدن آگار mL 0/5 از هر رقت در هر پلیت ریخته و پخش گردید. آنگاه 15-10 میلی لیتر آگار مغذي 45 درجه سانتیگراد مجددا روي هر پلیت ریخته شد و پس از منعقد شدن آگار، پلیتها در ظرف کشت بی هوازي و در دماي 37 درجه بمدت 36-24
ساعت قرار داده شدند. براي تعیین جمعیت میکربهاي خاك، پلیتی براي شمارش انتخاب شد که حاوي 100-20
کلنی بود. بعد از شمارش با در نظر گرفتن رقت هر پلیت،
تعداد میکربها در یک میلی لیتر محلول خاك رقیق شده که معادل (n)10x است، بدست آمد که در آن n معادل تعداد کلنی و x معادل ضریب رقت است .(14)
مطالعات آناتومیک : بهمنظور مطالعات آناتومیک از گیاهان
8 هفتهاي استفاده شد. از ریشه گیاهان 7 تا 11 برش عرضی به ضخامت یک لایه سلول و به روش دستی تهیه شد. پس از قرار دادن و شستشوي نمونهها بهترتیب در آب ژاول 1٪ بمدت 20 دقیقه و اسید استیک 1٪ بمدت 1
دقیقه نمونهها رنگآمیزي شدند. رنگآمیزي بوسیله کارمن زاجی و سبزمتیل انجام شد. نمونههاي رنگآمیزي شده با استفاده از میکروسکوپ نوري Olympus مدل BX51TF
بررسی شدند.
تجزیه و تحلیل آماري دادهها: کلیه آزمایشات در چهار تکرار انجام شد. تجزیه آماري دادهها با روش تجزیه واریانس (ANOVA) بوسیله نرمافزار spss انجام شد. براي مقایسه میانگین دادهها از آزمون Tukey استفاده شد.
نتایج
میانگین غلظت نفت در خاك مورد آزمایش حدود 21600mg/kg بدست آمد. مطالعه ریشه گیاهان بیانگر آسیبپذیري بیشتر ذرت در مواجه با آلایندههاي نفت در مقایسه با گیاهان دیگر بود. هر چند هر سه گیاه واکنش دفاعی قابل توجهی در سطح ریشه و خاك نشان دادند.
جدول -1 نتایج اندازهگیري طول ریشه و غلظت پروتئین در تیمارهاي آلوده و شاهد (میانگین±انحراف معیار).
غلظت پروتئین (mg/g) طول ریشه (cm) گیاهان
شاهد آلوده شاهد آلوده
0/0026±0/0002b 0/0063 ±0/0002a 28/4±8/3a 24/8±5/7b ذرت
0/0061 ±0/0003b 0/012 ±0/0009a 8/4 ±8/9b 13/6±8/1a آفتابگردان
0/035 ±0/007b 0/75 ± 0/01a 7/3±9/3a 3/4±5/9b جودوسر
تفاوت میانگینها در سطح (p< 0/05) معنیدار است.
503
مجله پژوهشهاي گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
بررسی رشد گیاهان در ذرت و جودوسر نمایانگر اثرات ریشه گیاهان مبین افزایش قابل توجه غلظت پروتئین هر
منفی هیدروکربنهاي نفت خام بر رشد ریشه این گیاهان سه گیاه در خاك آلوده بود. هرچند این افزایش در ریشه
بود، درحالیکه در آفتابگردان ریشه آلوده افزایش جودوسر آلوده بسیار چشمگیر بود (جدول .(1
معنیداري در رشد داشت. اندازهگیري غلظت پروتئین
تعداد میکربها در هر میلی لیتر سوسپانسیون رقیق
نشده میکربی
1600 1400 1200 1000
800 600 400 200
0
فاقد گياه جودوسر آفتابگردان ذرت
ب
جمعیت
تعداد میکربها در هر میلی لیتر سوسپانسیون رقیق
نشده میکربی
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
فاقد گیاه جودوسر آفتابگردان ذرت
الف
جمعیت
شکل - 1 مقایسه میانگین جمعیت میکربهاي محیط ریشه گیاهان با تیمار شاهد (خاك آلوده فاقد گیاه) الف: میکربهاي هوازي ب:
میکربهاي بی هوازي (تفاوت میانگینها در سطح (p< 0/05) معنیدار است).
ث پ الف
60µm 200µm 200µm
ج ت ب
60µm 200µm 200µm
شکل -2 مقایسه تغییرات بافتهاي ریشه گیاهان در خاکهاي آلوده و غیرآلوده یا شاهد در برش عرضی ریشه الف: آفتابگردان غیرآلوده ب: آفتابگردان آلوده پ: جودوسر غیرآلوده ت: جودوسر آلوده ث: ذرت غیرآلوده ج: ذرت آلوده
504
Calopogonium mucunoides
مجله پژوهشهاي گیاهی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
اثرات تحریک کننده ریشه کلیه گیاهان بر رشد و توسعه جمعیت میکربهاي خاك جالب توجه بود. این در حالیست که ریشه برخی گیاهان مثل ذرت با وجود آسیبپذیري و پارگی بافت پارانشیم (نتایج آناتومیک) در تحریک میکروارگانیسمهاي خاك آلوده عملکرد مؤثري داشت.
ذرت و آفتابگردان در تحریک میکربهاي بی هوازي و جودوسر در تحریک میکربهاي هوازي محیط ریشه مؤثر بودند، در مقابل جمعیت میکربهاي هوازي ذرت و آفتابگردان و همچنین جمعیت میکربهاي بی هوازي در جودوسر کاهش قابل توجهی در مقایسه با خاك شاهد داشت (شکل .(1 در مطالعات میکروسکوپی مقایسه بافتهاي ریشه گیاهان آلوده و غیرآلوده تغییر ساختاري یا آسیب جدي را در ریشه آفتابگردان و جودوسر نشان نداد.
در ذرت از هم گسیختگی بافت پارانشیم و آسیبدیدگی سلولها واضح بود و در بعضی قسمتها پارگی بافت عمیقتر بود ( شکل .(2
بحث
از اولین علائم مسمومیت گیاهان در خاکهاي آلوده به نفت بازدارندگی رشد و بعد کاهش رشد است. خاصیت آبگریزي ترکیبات نفتی موجب تغییر رفتار خاك و ناهمگن شدن انتشار آب در خاك میگردد. این مسئله موجب کمبود آب در خاك و ایجاد شرایط خشکی در خاك میشود و قابلیت دسترسی گیاهان به آب و مواد مغذي کاهش مییابد (2)، در نتیجه رشد و تولیدات گیاهی کاهش مییابد. کاهش رشد گیاهان بهویژه ریشه در مطالعات بسیاري از محققان گزارش شده است 17)و.(29
مطالعات بنگوش در سال 2003 نشان داد که وجود نفتهاي سنگینی مثل آسفالتن در خاکهاي آلوده به نفت موجب بوجود آمدن نوعی نیروي مکانیکی مقاوم در خاك میگردد که طویل شدن ریشههاي گیاهان را کند میسازد. کاهش رشد طولی ریشه ذرت و جودوسر با توجه به ویژگیهایی که از خاکهاي آلوده پالایشگاه ذکرشد، بعلت بالا بودن
میزان نفتهاي سنگین در این خاکها بود. اما ریشه آفتابگردان در شرایط آلوده افزایش رشد را نشان داد. در سال 2004
مطالعات مرك و همکاران بر روي گیاهان گرمسیري در خاکهاي آلوده به نفت خام نشان داد که ریشههاي
و Centrosema
brasilianum در مقایسه با ساقه در خاکهاي آلوده افزایش رشد دارند، بهطوريکه نسبت رشد ساقه به ریشه این گیاهان در شرایط آلوده کاهش مییابد. آنان دریافتند که این مسئله نوعی پاسخ دفاعی و یا استراتژي گیاه در مواجه با کمبود دسترسی به مواد مغذي در خاك آلوده است، زیرا افزایش رشد و بیوماس ریشه موجب افزایش جذب نیتروژن خاك میشود .(16) افزایش رشد ریشه آفتابگردان در خاك آلوده احتمالا نوعی مکانیسم دفاعی براي دسترسی بهتر به مواد مغذي خاك بود.
در سال 1995 اسنور و همکارانش دریافتند که آنزیمها عامل اصلی تغییر آلایندههاي مخلوط با خاك و رسوبات هستند. یافتههاي آنها نشان داد که آنزیمها از طریق واکنشهاي تجزیهاي قادرند آلایندههاي آلی را تغییر داده و تجزیه کنند. آنان با بررسی ترشحات ریشه و جداسازي انواع آنزیمها شامل دهالوژناز، نیتروردوکتاز، پراکسیداز، لاکاز و نیتریلاز را شناسایی کردند. افزایش غلظت پروتئین ریشه جودوسر در شرایط آلوده ممکن است یک افزایش مصنوعی و به علت تنش آب باشد یا بدلیل افزایش تولید یا انتقال آنزیم در ریشه بهمنظور افزودن بر فعالیت ترشحی باشد. ترشح آنزیم از ریشه نوعی واکنش دفاعی گیاه براي تجزیه هر چه سریعتر آلایندههاي نفت خام و کاستن سطح غلظت مسموم کننده نفت در خاك است.
