بخشی از مقاله
گزارش کار کشت باکتری
مقدمه :
تعریف کشت :
هنگامیکه باکتریها در شرایطی مناسب قرار گیرند که قادر به تکثیر و رشد باشند اصطلاحا گفته می شود باکتری کشت داده شده است .
تعریف محیط کشت :
از آنجا که میکروب یک موجود تک سلولی بوده و قادر است کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلا انجام دهد بدون آنکه نیاز به سلول دیگری داشته باشد . این اصل بیانگر آن است که میکروبها هم احتیاج به غذا و آب و موادآلی و معدنی دارند. محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی و عناصر و غیره باشد که موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحا محیط کشت می گویند.
براي مطالعه ميكروارگانيسم ها بايد بطريقي آنها را بر روي محيطهاي مناسب از نظر شرايط فيزيكي و شيميايي كشت داد . مطالعه زياد درباره ميكروارگانيسم ها و نحوه زندگي آنها باعث شده كه تا كنون انواع زيادي از محيط كشت با تركيبات متفاوت به طور مصنوعي براي استفاده در آزمايشگاههاي ميكروبيولوژي تهيه شود . هرچند انواع اين محيط كشت ها زياد مي باشند، معهذا در مواردي براي كشت نوع بخصوصي از يك ميكروارگانيسم بايد از يك نوع محيط كشت بخصوص با تركيبات مشخص استفاده شود.
بطور كلي محيط هاي كشت بايد داراي مشخصات معيني باشند و هنگام تهيه و استفاده از محيط كشتها بايد به نكات زير توجه شود :
تمام محيط كشتها بايد واجد مواد غذايي ضروري براي رشد ميكروبها باشند
PH محيط كشت بايد در حد معين قبل از استفاده براي كشت تنظيم شود.
ظروف مورد استفاده براي تهيه محيط كشتها بايد كاملا تميز و عاري از مواد خارجي باشند .
آب مقطر مورد استفاده بايد بطريقه صحيح تهيه شود .
درجه حرارتي كه براي استريل كردن محيط كشت مصرف مي شود بايد نسبت به نوع مواد غذايي مربوط در محيط كشت در نظر گرفته شود . درجات بالا باعث از بين رفتن برخي از مواد شيميايي موجود در محيط كشت مي شوند .
محيط هاي كشت باكتريها به سه صورت زير تهيه ميشود :
محيط كشت مايع يا آبگوشتي (liquid or broth media)
محيط كشت جامد (solid media)
محيط كشت نيمه جامد (semi solid media)
محيط كشت مايع ( براث ) :
اين محيط فاقد آگار و فقط در لوله آزمايش يا فلاسك استفاده ميشود . مثل محيط نوترينت براث.
محيط كشت جامد :
اين محيط حاوي 5/1 تا 2 درصد ماده آگار است كه بعد از سرد شدن منعقد مي شود . محيط كشت جامد را درون لوله آزمايش يا پليت استفاده مي كنند.مثل محيط TSI و M.c
دليل بكارگيري محيط جامد ، تشخيص باكتريها به وسيله :
تشكيل كلني
توليد پيگمانت
خصوصيات خاص هر كلني
تشخيص انواع باكتريها كه چند نوع باكتري در نمونه ميكروبي وجود دارد .
موكوئيدي بودن باكتري
ديدن منطقه هموليز .
محيط كشت نيمه جامد :
اين محيط در تركيب خود مقدار كمي آگار دارد . بنابراين كاملا منعقد نمي شود و نيمه جامد باقي مي ماند . مثل محيط SIM .
آگار :
ماده اي پلي ساكاريدي است كه از يك نوع جلبك قرمز دريايي تهيه مي شود، در c° 95 ذوب و در حرارت c° 42 منعقد مي گردد .
محيط هاي كشت باكتري را از نظر نوع مواد تشكيل دهنده و از نظر كاربرد به چهار دسته تقسيم مي كنند:
محيط كشت پايه (Basic Media) :
اين محيط كمترين مقدار مواد غذايي براي رشد باكتريها را دارد . و مبناي تهيه انواع و اقسام محيطهاي كشت مي باشد . اكثر انواع باكتريها در آن رشد مي كنند زيرا فاقد ماده ضد ميكرب است . مانند محيط نوترينت آگار ، نوترينت براث .
محيط كشت غني كننده (Enrichment Media) :
محيط مقوي بوده كه داراي مواد تغذيه اي زيادي نظير ويتامين ها ، ليپيد ها ،
اسيد هاي آمينه براي رشد باكتري است . بنابراين تعداد زيادي از باكتريها روي آن بخوبي رشد مي كنند . مانند شكلات آگار، بلادآگار .
محيط كشت افتراقي (Differential Media) :
محيط كشت تشخيصي بوده كه كلني باكتريهاي مختلف روي آن كاملا از همديگر متمايز مي گردد. مانند محيط E.M.B ، M.c اين محيطها داراي املاح صفراوي ، قند و معرف شيميايي هستند كه باكتريهاي لاكتوز مثبت برروي آنها كلني هاي صورتي رنگ و باكتريهاي لاكتوز منفي نظير سالمونلا ، شيگلا بر روي اين محيط ها كلني هاي سفيد رنگ تشكيل مي دهند . از محيطهاي افتراقي ديگر محيط TSI ، سيمون سيترات را ميتوان نام برد . اين محيط ها براي رشد باكتريهاي گرم – منفي روده اي (انتروباكترياسه) مناسب هستند . چون وجود املاح صفراوي در محيط مانع از رشد باكتريهاي گرم مثبت در محيط مي شوند.
محيط كشت اختصاصي (Special Media) :
اين محيطها براي رشد باكتريهاي خاصي مناسبند . از اين محيطها براي ايزوله نوع خاصي از باكتري در يك مخلوط ميكربي استفاده مي شود . مانند محيط s.s آگار كه براي جدا كردن سالمونلا و شيگلا بكار ميرود يا مانيتول سالت آگار كه براي تشخيص گونه بيماريزاي استافيلوكوكوس اورئوس استفاده مي شود .
محيط كشت انتخابي : (Selective Media )
محيط هايي وجود دارند كه داراي يك ماده مهار كننده رشد مي باشند اين مواد رشد تمام ارگانيسم ها بجز ارگانيسم مورد نظر را مهارمي كنند . درمرحله اول از رنگ هايي كه داراي خواص ضد ميكروبي هستند استفاده مي شود ودر مرحله بعد استفاده از آنتي بيوتيك ها و مرحله آخر شامل وارد كردن مواد تركيبي به محيط كشت جهت فعاليتهاي متابوليكي ارگانيسم مورد نظر مي باشد . از آنجا ئيكه اين محيط ها جهت ارگانيسم مورد نظر انتخاب شده اند و براي ساير ارگانيسم ها مضر مي باشند آنها را محيط هاي انتخابي مي نامند . مثالي از اين نوع محيط ها ، محيط كشت فنيل اتيل الكل آگار است كه از رشد باسيل هاي گرم منفي هوازي و بي هوازي اختياري ممانعت بعمل آورده و به ارگانيسم هاي گرم مثبت اجازه رشد مي دهد .
طرز تهيه كلي محيط هاي كشت :
همانطوريكه مي دانيد محيطهاي كشت به سه دسته جامد ، نيمه جامد ، مايع تقسيم مي شوند . محيطهاي مايع معمولاً فاقد آگار هستند يا مقدار آگارشان بسيار كم است . مثلاً حدود ( 2/0%) و محيط هاي نيمه جامد داراي مقدار كمي آگار حدود 3- 2 گرم وبالاخره محيط هاي جامد كه داراي 15- 13 گرم آگار در ليتر محيط هستند .
براي ساختن محيط هاي كشت باكتري، ما از پودر مخصوص كه در شيشه هاي مربوطه قرار دارد، استفاده مي كنيم. در روي اين شيشه ها تركيب محيط بطور كامل و همچنين طرز ساختن آن نوشته شده است . مثلاً براي ساختن نوترينت آگار ابتدا مقدار لازم از پودر آن را وزن كرده ودر مقدار معيني آب مقطر كه قبلاً در يك ارلن ماير يا بطري ريخته ايد اضافي نموده و آنرا كاملاً حل نمائيد وسپس با پنبه درب ارلن ماير را مسدود كرده و آن را روي سه پايه چراغ گازي حرارت مي‌دهيد
، تا زمان جوشيدن آنرا چند بار تكان دهيد تا خوب حل شود و بمدت يك دقيقه بجوشد پس از آنكه مايع بجوش آمد ، آنرا برداشته وبا تكه كاغذ آلومينيومي روي پنبه را مي‌پوشانيد وظرف را در اتوكلاو مي‌گذاريد تا در فشار 15 پاند بر اينچ مربع و حرارت 121 درجه سانتيگراد به مدت 15 دقيقه استريل شود . بعد از استريل كردن بگذاريد تا خنك شود تا حدود c450- 40 . سپس در حاليكه ارلن را در دست راست گرفته و پنبه آنرا با دست چپ كنار شعله خارج كرده‌ايد ، دهانه ارلن را يكبار از درون شعله گاز عبور دهيد وبعد درون پليت هاي استريل شده بين cc20- 15 از محل محلول بريزيد . بعد پليت ها را در كناري بگذاريد تا سرد شوند
وازتكان دادن آن خودداري نمائيد وپس از جامد شدن محيطهاي كشت نوترينت آگار را جمع كرده ودر c370 بمدت 24 ساعت قرار دهيد . اگر محيط ها آلوده نشده باشند آنها را از c370 بيرون آورده و در يخچال 4 درجه سانتي گراد قرار مي‌دهيد .
طرز ساختن ساير محيطهاي كشت، همينطور مي‌باشد منتهي بعضي از محيطهاي جامد در لوله مستقيم، پس از جوشاندن ريخته شده و بعد استريل مي‌شوند كه اين محيطها را پس از استريل شدن، به طور ايستاده مي‌گذاريم مثل محيط SIM و يا كج مي‌گذاريم مثل محيط TSI تا سرد شوند .
براي ساختن محيط مايع (براث) پس از جوشاندن، محيط را در لوله ها تقسيم مي‌كنيم و سپس با پنبه‌اي درب آنها را مسدود كرده و جهت استريل داخل اتوكلاو قرار مي‌دهيم .
انواع محيط هاي كشت
محيط هاي كشت عمده اي كه در آزمايشگاه مورد استفاده قرار مي‌گيرند عبارتند از :
محيط نوترينت براث (Nutrient broth ):
اين محيط مبناي ساخت اكثر محيطهاي كشت است و از عصاره گوشت تهيه ميشود طرز تهيه آن مثل نوترينت آگار مي‌باشد . اين محيط بدليل نداشتن آگار بصورت مايع در لوله آزمايش تهيه مي شود .
محيط نوترينت آگار (Nutrient agar):
چنانچه ماده آگار را به نسبت 5/1 تا 2 درصد با آبگوشت غذايي مخلوط كنيم، اين آگار غذايي بدست مي‌آيد . اين محيط مبناي تهيه انواع و اقسام محيط هاي كشت جامد مثل Blood Agar , Chocolate agar مي باشد .
محيط آگار خوندار (Blood agar) :
اغلب نمونه هاي رسيده به آزمايشگاه ميكروب شناسي بر روي محيط آگار خوندار كشت داده مي‌شوند، چون اين محيط از رشد تمام واغلب باكتريهاي سخت رشد حمايت كرده و اغلب ميكروب شناسان عادت دارند بر اساس مورفولوژي كلني بر روي آگار خوندار تصميم گيري نمايند . اين محيط از يك محيط پايه مانند تريپتون كه منشاء پروتئيني دارد، كلريد سديم آگار و 5 درصد خون تشكيل شده است . برخي باكتريها آنزيم هاي خارج سلولي توليدكرده كه بر روي گلبولهاي قرمز عمل كرده و آنها راكاملاً ليز مي‌كند (هموليزبتا ) يا يك تغيير سبز رنگ در اطراف كلني ايجاد مي‌كند ( هموليز ناقص يا آلفا ) در صورتي كه برخي از باكتريها تغييري ايجاد نمي‌كنند ( هموليزگاما) توليد هموليزين بوسيله باكتري به بسياري از فاكتورهاي محيطي مانند PH ، اكسيژن و دما بستگي دارد. ميكروب
شناسان اغلب از مورفولوژي كلني و توليد هموليزين به عنوان آزمايشات غربالگري اوليه جهت كمك به تصميم در انتخاب مراحل ديگر جهت شناسايي يك باكتري استفاده مي‌كنند. جهت مطالعه درست واكنش هموليتيك بر روي آگار خوندار، كارشناس بايستي پليت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نمايد. اگر از لوپ جهت كشت خطي بر روي آگار خوندار استفاده ميشود بايد آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانيسم بتواند در زير سطح محيط كه اكسيژن كمتري دارد رشدكند . توليد هموليزين هاي حساس به اكسيژن در برخي از ارگانيسم ها بدين وسيله تشديد مي‌گردد . به روش ديگر، ميتوان پليت‌ها را جهت مشاهده واكنش هموليزين حساس به اكسيژن به طريق
بي هوازي نيز انكوبه نمود.
طرز تهيه انواع محيط هاي كشت :
1- ابتدا مقداري آب مقطر در داخل يك ارلن ريخته پودر نوترينت آگار را به آن اضافه و حل نمائيد .
2- محتويات ارلن را با آب مقطر به حجم برسانيد .
3- محتويات ارلن را روي شعله حرارت دهيد تا بجوشد و محيط شفاف شود .
4- محيط كشت را توسط اتوكلاو 15 دقيقه درحرارت c 1210 استريل كنيد .
5- پس از استريل كردن، بگذاريد تا حرارت محيط كشت به 0c50- 45 برسد آنگاه در شرايط استريل ودر مجاورت شعله ، با توجه به حجم محيط ساخته شده، 10ـ 5 درصد خون گوسفند به آن اضافه نموده و خوب بهم بزنيد تا كاملاً مخلوط شود .
6- محيط را در مجاورت شعله داخل پتري ديش هاي استريل بريزيد .
7- پس از پخش محيط در داخل پليت ها چنانچه در سطح آنها حبابهاي هوا تشكيل شود، بااستفاده از شعله حبابها را از بين ببريد .
8- ضخامت لايه آگار داخل پليت ها نبايد از 4-3 ميلي متر تجاوز كند .
9- پس از آماده و منجمد شدن محيط هاي ساخته شده، پليت ها را به مدت 24 ساعت در حرارت c370 انكوبه كنيد . رشد باكتري بر روي اين محيطهاي كنترل ، نمايانگر آلوده بودن محيط ها است . بنابراين از اين محيطهاي آلوده نبايد استفاده كرد .
محيط بلاد آگار در داخل يخچال به مدت يك هفته پايدار است و چنانچه بنحوي از تبخير آب آن جلوگيري شود، پايداري آن بيشتر ميشود .
محيط شكلات آگار(Chocolate agar):
در ساختن اين محيط از محيط آگار استفاده مي شود . پس از آماده نمودن و استريل كردن محيط پايه ، خون را هنگامي كه هنوز داغ است ( در حدود 0c85 ) به آن اضافه مي كنيم .گلبولهاي قرمز در اين حالت ليز شده و محيط رنگ شكلاتي ـ قهوه اي به خود مي‌گيرد . اكنون هموگلوبين و ساير مواد مغذي موجود در گلبولهاي قرمز درمحيط وجود دارند . همين ( Hemin ) كه فاكتور x خوانده مي شود و كوآنزيم نيكوتين آدنين دي نوكلئوتيد (NAD) كه فاكتور V خوانده ميشود ، به عنوان مكمل به محيط پايه آگار غني از مواد مغذي اضافه مي‌گردند . نايسريا گونوروه و گونه‌هاي هموفيلوس در ميان ساير ارگانيسم هاي سخت رشد، رشد بهتري درحضور مواد مغذي مكمل اضافه شده به شكلات آگار دارند .
محيط ائوزين متيلن بلو (E.M.B) :
يك محيط افتراقي در بردارنده لاكتوز با پپتون وائوزين متيلن بلو است . رنگهاي انيليني موجود در محيط ( ائوزين ، متيلن بلو ) مانع از رشد باكتريهاي گرم ـ مثبت مي شوند .
اين رنگها همچنين در PH اسيدي باهم تركيب شده وايجاد رسوب مي نمايند . بنابراين مي توان از وجود آنها بعنوان شاخصي جهت تخمير لاكتوز و توليد اسيد نيز استفاده نمود .
باكتريها گرم ـ منفي بر اساس تخمير يا عدم تخمير قند لاكتوز كلني هاي صورتي و يا بي رنگ تشكيل مي دهند .
باكتري اشرشيا كلي ( E.coli ) كه لاكتوز را بشدت تخمير نموده و مقدار زيادي اسيد توليد مي نمايد، بر روي اين محيط داراي جلاي فلزي سبزرنگ مي باشد .
كلبسيلا، انتروباكتر، سراشيا كه تخميركنندگان ضعيف لاكتوز هستند بر روي محيط كلني هاي ارغواني توليد مي نمايند .
پروتئوس، سالمونلا، شيگلا كه قادر به تخمير لاكتوز نيستند بر روي اين محيط
كلني هاي شفاف ايجاد مي‌كنند .
محيط مك كانكي (Mac conkey agar) :
مك كانكي آگار معمولترين محيط كشت انتخابي ـ افتراقي بوده وداراي رنگ كريستال ـ ويوله جهت ممانعت از رشد باكتريهاي گرم ـ مثبت و انديكاتور قرمز خنثي (Nautral red) جهت نشان دادن خصوصيات افتراقي مي باشد . با سيل هاي گرم ـ منفي به‌آساني بر روي اين محيط رشدنموده و باكتريهاي تخمير كننده لاكتوز ، محصولات اسيدي توليد نموده كه سبب كاهش PH در محيط اطراف كلني مي گردد . انديكاتور قرمز خنثي در PH اسيدي قرمز رنگ ميشود . پس ميكروارگانسيم هاي لاكتوز ـ منفي بي رنگ و شفاف مشاهده مي شوند . مك كانكي آگار محيط انتخابي و افتراقي مورد استفاده جهت گونه‌هاي شيگلا مي باشد .
طرز تهيه محيط E.M.B و M.C مثل تهيه محيط نوترينت آگار مي‌باشد .
محيط سالمونلا ـ شيگلا (s.s) :
در محيط S.s تركيباتي مانند پپتون ، لاكتوز ، املاح صفراوي ، نوترال رد، آگار، بريلين گرين ، تيو سولفات سديم وجود دارد . اين محيط فقط اجازه رشد به
باكتري هاي سالمونلا و شيگلا را مي دهد . بريلين گرين موجود در محيط مانع رشد باكتريهاي گرم ـ مثبت و ديگر گرم منفي ها در محيط S.s مي شود . با استفاده از اين محيط ميتوان سوشهاي تخمير كننده لاكتوز را از سوشهايي كه توانايي تخمير لاكتوز را ندارند، تشخيص داد .
