بخشی از مقاله
مقدمه
بیش از یک قرن از شناسایی عامل بیمـاری مهلـک بوتولیـسم گذشته (1) و نـشان داده شـده اسـت کـه عامـل بیمـاری یـک توکسین پروتئینی است که به دلیل تأثیر بر محل اتصال عـصب عضله و ایجاد فلج شل، نوروتوکسین نام گرفتـه اسـت. در واقـع این توکسین یکی از قویترین سموم شناخته شده میباشـد .(2)
با آن که از بدو شناسایی بوتولیسم تاکنون تحقیقات گـستردهای در زمینههای باکتریشناسی، سمشناسی، درمان و پیشگیـری از این بیماری انجام شده است؛ با وجود این، از جنبههـای مختلـف بهداشتی، درمانی و بیولوژی (3) هنوز هم برای بسط و گـسترش تحقیق پیرامون توکسین تیپ A بوتولینوم دلایل متعـددی ذکـر شده
است که اهم آنها عبارتنـد از: اسـتفاده از ایـن توکـسین در درمان تعداد زیادی از بیماریهای اسپاسمودیک که بهعنوان یک داروی فراگیر با نتایج درخشان همراه بوده است .(4 -6)
همچنین، تهیه آنتیبادیهای پلی و منوکلونال به منظور درمان بوتولیسم و نیـز تحقیـق جهـت تهیـه و تولیـد واکـسن کـارآ از اولویــتهــای مهــم پزشــکی درآمــده اســت .(7-9) شناســایی مکانیسمهای مختلف بیولوژیک، کاربرد این سم را در پزشـکی و نیز در تحقیقات اجتنابناپذیر کرده اسـت 10)و .(11 بـه عـلاوه، کنترل مواد غذایی و جلوگیری از بیماری مهلک بوتولیسم بـسیار حایز اهمیت است 12)و .(13 همچنین، دستیابی به روشهـای تشخیص سریع سم بوتولیسم با استفاده از فعالیت کاتالیتیـک آن بر سوبسترای اختصاصی از روشهای معتبر ذکر شده است .(14)
در تمام این موارد، تولید سم، حذف مواد زایـد و ناخالـصیهـای همراه آن، بهطوریکه خللی در فعالیت بیولوژیک آن وارد نـشود، از نکات بسیار ضروری است. بهعبارت دیگر جلوگیری از کاهش فعالیت، بیولوژیک توکسین بوتولینوم بسیار حـائز اهمیـت اسـت.
دکتر رمضانعلی عطائی و همکاران
یکی از روشهای حفظ فعالیت بیولوژیک این سم نگهـداری آن در حالت کریستالیزه است. ازاین رو، هدف ایـن تحقیـق تولیـد و کریستالیزاسیون سم A بوتولینوم در شرایط آزمایشگاه است.
روش کار
در این تحقیق موش سفید آزمایشگاهی به وزن 18 تا 22 گرم از انستیتو پاستور ایران، کلستریدیوم بوتولینـوم تیـپ A و پـادتن اختـــصاصی توکـــسین تیـــپ A کلـــستریدیوم بوتولینـــوم از Tarasoich Musco، محـیط کـشت تریپتیکیـز سـوی بـراث١ سیـستئین هیدروکلرایـد، عـصاره مخمـر٢، گلـوکز منوهیـدرات، هیدروکسید سدیم، کلرایـد کلـسیم، جـار و گـاز پـک از مـرک، آمونیوم سولفات، اسید کلریدریک، اتانل، اسید تریکلرو اسـتیک اسید، پلیآکریلآمید، بیسآکریلآمید، آمونیوم پرسولفات، تمـد و آگاروز از سیگما و فیلتر میلیپور 0/45میکرومتـری، فیلتـر 20 و 100 کیلودالتون از سارتوریوس تهیه گردید.
بهمنظور کشت توکسین 2 لیتر محیط تولیـد توکـسین تهیـه و استریل گردید 121) درجه سانتیگراد و فشار 15 پوند، بـهمـدت
15 دقیقه). سپس به نسبت 2 تا 3 درصد بـا کـشت 24 سـاعته٣
(حـاوی 6/3 × 10 8 سـلول در میلـیلیتـر) تلقـیح و در شـرایط استریل (زیر هود بیولوژیک) در شیـشههـای مخـصوص کـشت خون توزیع گردیـد 70) میلـیلیتـر در هـر شیـشه) و در شـرایط بیهوازی (استفاده از جار و گاز پک) گرمخانهگذاری شـدند و در زمانهای صفر، 2، 4، 6، 10،8، 12، 18، 24 ، 48، 72، 96، 108
و 120 سـاعت، هـر یـک را از شـرایط بـیهـوازی خـارج و 10
میلیلیتر آن را برداشته و جهـت انـدازهگیـری میـزان جـذب در طولموج 545 نانومتر، انـدازهگیـری مقـدار پـروتئین٤ و تعیـین نوروتوکسیسیتی بهکار رفت .(15)
از هــر یــک از شیــشههــای کــشت کــه بــهمــدت مشخــصی گرمخانهگذاری شده بودند، کدورتسنجی انجام شد. بدینترتیب که 0/5 میلیلیتر از سوسپانـسیون کـشت را در لولـه مخـصوص
(کوت) اسپکتروفتومتر ریخته و 4/5 میلیلیتـر آب مقطـر بـه آن اضافه گردید و در طول موج 545 نانومتر میزان جذب آن تعیـین گردید .(15)
از هر یک از شیشهها که در زمان تعیین شده گرمخانـهگـذاری شده بودند، 10 میلیلیتر برداشته و سانتریفوژ گردیـد 5000) دور بهمدت 20 دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگـراد) و بـا فیلتـر 0/45
1 Trypticase soy broth 2 Yeast extract 3 Pre- culture 4 Total protein
27
میکرومتری استریل شد. سپس با اسـتفاده از روش بـراد فـورد٥ غلظت کل پروتئین (پروتئین توتال) اندازه گیری شد .(16)
برای تعیین نوروتوکسیسیتی هر یک از کـشتهـا، پـس از 96
ساعت گرمخانهگذاری، 0/3 تا 0/5 میلیلیتر از عـصاره اسـتریل شده کشت، بهصـورت داخـل صـفاقی در مـوشهـای 18- 22
گرمی تزریق گردید و حداکثر تا 48 ساعت حیوان تحت مراقبـت بود. بهعلت محدود بودن تعداد مـوش از هـر نمونـه تنهـا بـه 3
موش تزریق میشد. این آزمون همیشه با کنترل 0/6) میلیلیتـر حاوی 0/3 میلـیلیتـر عـصاره اسـتریل شـده و 0/3 میلـیلیتـر آنتیتوکسین تیپ A کلـستریدیوم بوتولینـوم) همـراه بـود 17)و .(18
برای جداسازی توکسین، کشت 96 ساعته را با 10000 دور بـه مدت 15 دقیقه و دمای 4 درجه سـانتیگـراد سـانتریفوژ گردیـد.
مایع رویی را جدا نموده، ابتدا از فیلتر 20 کیلودالتون عبور داده و محلول تغلیظ شده باقیمانده از فیلتر 100 کیلودالتون عبـور داده شد. هر یک از محلولهای روی فیلتر 100 کیلودالتون، محلـول عبور کـرده از فیلتـر 100 کیلودالتـون و محلـول روی فیلتـر 20
کیلودالتون از نظر غلظـت نوروتوکسیـسیتی مـورد بررسـی قـرار گرفت.
کریستالیزاسیون توکسین تولید شـده بـر اسـاس روش سـوجی یاما٦ با مختصر تغییراتی در آن طی مراحل زیر انجـام شـد 19)و .(20
-1 کشت 4 روزه کلـستریدیوم بوتولینـوم تیـپ A را بـا اسـید سولفوریک اسیدی کرده (pH=3/4) و با قرار دادن آن در دمـای آزمایشگاه، پس از یک شب محتویات کشت بـهصـورت رسـوب درآمد.
-2 مایع رویی شفاف شده را خارج کرده، رسـوب جمـعآوری و با آب مقطر استریل شستشو داده شد (نحوه شستشو با سانتریفوژ
10000 دور به مدت 15 دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد). –3 رسوب حاصل را جدا نموده و در آب مقطـر بـا pH = 6/8
حل شد سپس کلراید کلیـسم بـه آن اضـافه گردیـد تـا غلظـت
0/075 مولار حاصل شود.
pH -4 محلول مرحله 3 را به 3/7 رسـانده تـا رسـوب سـمی شیری رنگ تشکیل شود.
-5 رسوب حاصل با سانتریفوژ جدا 10000) دور بـه مـدت 15
دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد) و در بافر فسفات 0/03 مـولار با pH = 6/8 حل گردید.
