بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه : کلستریدیوم نوئی به عنوان یک باکتري بی هوازي و تولید کننده آلفا توکسین که باعث ایجاد بیماري در حیوان و انسان می نماید شناخته شده است. این توکسین با اثر آنزیمی خود باعث غیر فعال سازي گیرنده هاي Rho و Ras در سلول هاي داراي این گیرنده ها شده و سلول ها را از بستر و یا از ارتباط با یکدیگر جدا می نماید. آلفا توکسین نوعی توکسین خارج سلولی است که توسط کلستریدیوم نوئی تیپ A تولید می گردد.
مواد و روش ها : باکتري کلستریدیوم نووئی پس از رشد و تولید توکسین به صورت نیمه خالص جداسازي و اثرات مختلف آن بررسی گردید. در این تحقیق، کشت 48 ساعته کلستریدیوم نوئی تیپ A به محیط کشت غنی شده اختصاصی تلقیح و در شرایط بی هوازي و دماي 37 درجه، تولید توکسین بررسی وتعیین گردید. به منظور انجام مراحل خالص سازي توکسین، با تغلیظ نمونه توسط پلی اتیلن گلیکول 6000 و انجام سانتریفوژ، رسوب حاصل جمع آوري گردید.
توکسین به ستون کروماتوگرافی سفادکسG-100 وارد شد و در نهایت جهت خالص سازي بیشتر آلفا توکسین کروماتوگرافی تعویض یونی انجام گرفت. در این بررسی با استفاده از تکنیک کشت سلول، اثر EDTA نیز برروي فعالیت آلفا توکسین کلستریدیوم نوئی تعیین گردید. اثر EDTA بر آلفا توکسین با روش کروماتوگرافی کاغذي نیز بررسی شد.
بحث و نتیجه گیري : وزن مولکولی آلفا توکسین کلستریدیوم نوئی به وسیله ژل الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات حدود 160 کیلو دالتن تخمین زده شد. توکسین داراي فعالیت سیتوتوکسیک بوده و با اثر بر روي سلول هاي Vero در کشت سلولی، باعث جدا شدن سلول ها از کف پلیت و گرد شدن آن ها می گردد. با تیمار آلفا توکسین توسط EDTA یک اثر افزایشی در فعالیت آلفا توکسین مشاهده شد. به طوري که با افزایش غلظت EDTA ، تغییر حالت و گرد شدگی سلول هاي توموري نیز سریع تر انجام گرفت. EDTA منجر به افزایش سرعت سیتوتوکسیک آلفا توکسین گردید و با اثربخشی EDTA به تنهایی بر روي سلول Vero هیچ فعالیت راندینگ مشاهده نشد.
مقدمه
در سال هاي گذشته تحقیقات بسیاري به منظور کشف عامل بیماري هایی که منجر به مرگ یا از بین رفتن فعالیت عضوي از بدن می گشت انجام گرفته است. باکتري کلستریدیوم نوئی اولین بار در سال 1894 از یک خوکچه هندي جدا گردید - . - 7 کلستریدیوم نوئی نوعی باکتري باسیلی و دوکی شکل، گرم مثبت و مولد هاگ بوده که در محیط بی هوازي رشد می کند. این باکتري در طبیعت در خاك و روده حیوانات یافت می شود
ژن هاي کلستریدیوم نوئی، توکسین هاي متنوعی با وزن مولکولی بالا تولید می کنند. 4 تیپ توکسین نوئی شامل A,B,C,D می باشد که بر اساس آنتی ژن هاي محلول مربوطه، طراحی شده اند. در این میان فقط تیپ A,B آلفا توکسین کشنده تولید می کند. آلفا توکسین تیپ A تنها فاکتوري است که هم کشندگی وهم تولید ادما می کند به طوري که عفونت هاي گاز گانگرن را در انسان و حیوان موجب می شود و تیپ B باعث عفونت هپاتیت نکروتیک - بیماري سیاه - در گوسفند و سایر حیوانات می گردد. تیپ C کلستریدیوم نوئی غیر پاتوژنیک است. همچنین بعضی از محققان کلستریدیوم همولیتیکوم را نیز جزء تیپ D کلستریدیوم نوئی می دانند
تحقیقات نشان می دهند که آلفا توکسین داراي فعالیت سیتوتوکسیک بوده وبا ایجاد تغییرات سیتوپاتیک و مورفولوژیکال در کشت انواع سلول به خصوص سلول هاي اندوتلیال سرطانی باعث گرد شدن سلولها و جدا شدن آنها از کف پلیت می گردد.
مکانیسم عمل این رده از توکسین ها تاکنون شناخته نشده است اما با مشاهده اثر آلفا توکسین برروي گرد شدن سلول ها، محققان این طور بیان می کنند که توکسین نوئی بر روي سیتواسکلتون سلولهاي اندوتلیال پستانداران تاثیر می گذارد و عمل مونو گلیکوزیلاسیون ترانسفراز توسط آلفا توکسین برروي گیرنده هاي پروتئینی Rho انجام می گردد و در نتیجه منجر به شکست ساختار سیتواسکلتون می گردد
در سال هاي اخیر بحث شناسایی کلستریدیوم نوئی و داشتن یک توکسین خالص و آنتی بادي آن خیلی مورد توجه قرار گرفته است، لذا خالص سازي توکسین سویه واکسنی و ارزیابی توکسین زایی و میزان فعالیت توکسین و اثر کشندگی آن از اهمیت خاصی براي تولید کنندگان واکسن برخوردار است. با توجه به تنوع سویه هاي این موجود، اطلاعات مشخص از توکسین آن می تواند تولید کنندگان را در بهینه کردن واکسن تولیدي و همچنین ارزیابی واکسن کمک نماید.
مواد و روش ها
آماده سازي محیط کشت
باکتري کلستریدیوم نوئی در محیط کشت غنی شده اختصاصی که شامل پروتئوز پپتون، تامپون، نمک کلریدسدیم ، مالتوز ، L– سیستئین، پودر جگر، عصاره مخمر همراه با افزودن ویتامین ها می باشد، تحت شرایط بی هوازي به مدت 48 ساعت در دماي 37 درجه سانتی گراد رشد داده شد
کشت سلول هاي توموري
با تهیه رده هایی از سلول هاي توموري کلیه خرگوش - - Vero cell از موسسه واکسن و سرم سازي رازي، سلول ها در محیط کشت کامل - RPMI حاوي - FBS 12% رشد و تکثیر یافتند تا پس از رسیدن به میزان کافی درتست سایتوتوکسیتی از آنها استفاده گردد
تعیین فعالیت سیتوتوکسیک آلفا توکسین
با حذف سلولهاي باکتري رسوب داده شده از سوپرناتانت حاصل که حاوي توکسین است رقت هاي مختلف آن تهیه گردید و بر روي پلیت حاوي سلولهاي Vero اثر داده شد
رسوب با پلی اتیلن گلیکول 6000
پس از اطمینان یافتن از فعال بودن توکسین باکتري، براي جداسازي توکسین، میزان 500 ml از کشت 48 ساعته در 6000 دوربه مدت 20 دقیقه سانتریفوژ گردید. به سوپرناتانت حاصل پودر پلی اتیلن گلیکول 6000 اضافه گردید تا به غلظت 12/5 درصد اشباع رسید. محلول اشباع در دور6000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ و غلیظ شد و 7 ml رسوب توکسین بدست آمد
کروماتوگرافی با سفادکس G-100
براي خالص سازي باندهاي پروتئین از روش کروماتوگرافی ستونی با استفاده از سفادکس G-100 در ستونی با ابعاد - r = 0.5 cm و - h = 90 cm استفاده گردید. خروجی ستون در حجم هایی به میزان 5ml تا 25 لوله جمع آوري شد. محتوي پروتئین لوله ها که از انتهاي ستون کروماتوگرافی جمع آوري شده بود با اسپکتروفوتومتر اندازه گیري گردید. ارزیابی میزان پروتئین در سنجش جذب مستقیم در طول موج 280 nm انجام شد. لوله هایی که حاوي پروتئین مورد نظر نبودند از پروسه کار حذف شدند
کروماتوگرافی تعویض یونی
توکسین خارج شده از مرحله کروماتوگرافی با سفادکس G -100 به ستون سفادکس DEAE وارد گردید - ستون سفادکس DEAE قبلا با بافر تریس 100 میلی مولار با 7/5 pH متعادل شده بود - و در نهایت به صورت مرحله اي توسط نمک کلرید سدیم 300 , 250, 200 , 150 , 100mM شستشو صورت گرفت و سپس فراکشن هاي حاصل جمع آوري گردید و بار دیگر جهت بررسی دقیق توکسین خالص شده تست SDS-PAGE انجام شد
تعیین وزن مولکولی
وزن مولکولی آلفا توکسین با استفاده از تکنیک - SDS-PAGE - سدیم دودسیل سولفات الکتروفورز ژل پلی اکریلامید تعیین شد و براي دیدن باند ها رنگ آمیزي نیترات نقره صورت گرفت
بررسی حضور یا عدم حضور فلز در ساختمان آلفا توکسین
به منظور اثبات حضور فلز در ساختمان آلفا توکسین EDTA را با غلظت 5 mM به توکسین نیمه خالص اضافه کرده تا امکان کلاته شدن یون فلزي توکسین - در صورت وجود - فراهم آید. توکسین در مجاورت EDTA به مدت 24 ساعت در دماي 4 درجه انکوبه گردید وبعد از گذشت این مدت زمان بر روي سلول هاي Vero اثر داده شد
تاثیر EDTA بر فعالیت آلفا توکسین
ابتدا آلفا توکسین با غلظت هاي مختلف1،2،5،10،15،20 میلی مولار از محلول نیم مولار EDTA که توسط PBS تهیه شده بود به مدت 20 دقیقه تیمار شد.
تاثیر EDTA بر فعالیت آلفا توکسین در کشت سلول
درون چاهک هاي حاوي محیط کشت سلول Vero ریخته شد. 5 چاهک براي هر نوع سلول در نظر گرفته شد.
جدول :1 ترتیب قرار گیري موارد تست در چاهک ها
نکته : آزمایشات به صورت دوبل تکرار شده است.
تاثیر EDTA بر فعالیت آلفا توکسین در تست کروماتوگرافی کاغذي
پس از تیمار آلفا توکسین با EDTA، مخلوط آن دو در مجاورت UDPG که نوعی سوبسترا است و بافر تریس باpH 7/5 و آب دیونیزه قرار گرفت. پس ازانکوباسیون آنها در دماي 37 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه بر روي کاغذ کروماتوگرافی قرار گرفت - . - 2 فاز متحرك، از ترکیب 3 حلال آب، پیریدین، -n بوتانول به نسبت 6:3:4 انتخاب گردید. پس از قرار دادن فاز متحرك به داخل تانک، کاغذ کروماتوگرافی در داخل تانک قرار داده شد. حرکت فاز متحرك تا 3cm به انتهاي کاغذ انجام گرفت.
