بخشی از مقاله
توزیع ژن های توکسین stx1، stx2، LT ، ST و ژن های آنتی ژن های O157و H7 دراشریشیا کلی جدا شده از بیماران با عفونت ادراری
چکیده
مقدمه: عفونت با سویه های مولد شیگا توکسین اشریشیا کلی (STEC) علاوه بر ایجاد اسهال
با عوارض وخیم و کشنده ای همچون سندروم اورمی همولیتیک (HUS) همراه است. این در حالی است که روش های تشخیصی این باکتری ها مشکل بوده و اطلاع دقیقی از میزان بروز عفونت آنها در ایران در دست نیست.
هدف: این مطالعه با هدف شناسایی مولکولی ژن های توکسین های stx1، stx2، LT، ST وهمچنین آنتی ژن های O157 و H7 در مبتلایان به اشریشیا کلی جدا شده از نمونه های
ادراری انجام گرفت.
روش: ًًَ نمونه E.coli از مبتلایان به عفونت ادراری از آزمایشگاههای استان تهران در سال َُ-ًُ جمع آوری گردید. پس از استخراج DNA از نمونه های E.coli ، حضور ژن های stx1، stx2، LT، ST وهمچنین ژن های آنتی ژن های O157 به روش PCR بررسی گردید. نتیجه تحقیق: ازمیان ًًَ نمونه E.coli جداشده ، ًَ نمونه ( ًٌ %) حاوی ژن stx1 ،ٌَ نمونه (ّ%) حاوی stx2، ّ نمونه (ٍ%) حاوی ژن LT مثبت بودند و هیچ کدام از نمونه ها حاوی ژن ST نبودند. همچنین َ نمونه ( ٌ%) حاوی ژن آنتی ژن O157 وٌٍ نمونه ( ْ%)
حاوی ژن آنتی ژن H7 بودند. َ نمونه بطور همزمان حاوی هر دو ژن stx1 و stx2 بودند.
نتایج نشان می دهد که سویه های ETEC وSTEC با حفظ نسبی مخزن ژنتیکی قادر به ایجاد عفونت ادراری نیز می باشند و به دلیل عدم شناسایی این سویه ها با روش های مرسوم
در آزمایشگاه ها، استفاده از تشخیص ملکولی به منظور شناسایی موارد مشکوک ضروری می باشد.
کلمات کلیدی: اشریشیا کلی ، عفونت اندام ادراری ، سندروم اورمی همولیتیک.
مقدمه
باکتری اشریشیا کلی یکی از موجودات زنده ای است که به شدت مورد مطالعه قرار گرفته
است. عفونت ادراری اشریشیا کلی (UPEC) مسئول ًْ-ًُ درصد از موارد سیستیس حاد و
هزار مورد از گزارشات سالانه پیلونفریت در ایالات متحده می باشد( ٌٌ). سویه های اشریشیا کلی وروتوکسیژنیک ( (VTEC توکسینی ترشح می کنند که به دلیل توانایی آن
درکشتن سلول های vero، وروتوکسین یا توکسین شبه شیگا نامیده می شود و سویه های
تولید کننده آن به STEC معروف می باشند(ٌ). توکسین های ورو به دو گروه stx1 و stx2
تقسیم بندی می شوند. وروتوکسین ها با اثر بر روی RNA ریبوزومی مانع از سنتز پروتئین
می گردد. انواعی از اشریشیا کلی که این سم را تولید می کنند موجب سندروم های خطرناکی
از جمله کولیت هموراژیک ( (HC و به دنبال آن نارسایی کلیوی و پورپورای ترومبوتیک در انسان می گردند ( ٌوُوِ). همچنین اشریشیا کلی انتروتوکسیژنیک ( (ETEC علت شایع
اسهال مسافرتی است و علت مهم اسهال در نوزادان در کشورهای در حال توسعه محسوب می شود. بعضی از سویه های ETEC یک اگزوتوکسین حساس به حرارت به نام LT تولید می کنند که تحت کنترل یک پلازمید قرار دارد. برخی از سویه های ETEC یک انتروتوکسین مقاوم به حرارت به نام ST تولید می کنند که تحت کنترل ژنتیکی گروه ناهمگونی از پلازمیدها قرار دارد. باعث فعال شدن آدنیل سیکلاز توسط LT منجر به افزایش ترشح طولانی
و شدید آب و یون کلر و جلوگیری از بازجذب مجدد سدیم می گردد و سبب ایجاد اسهال
می شود. ST گوانیلیل سیکلاز را در سلول های اپی تلیال روده فعال می کند و موجب ترشح
مایعات می شود. سویه هایی که هر دو توکسین ST وLT را تولید می کنند موجب اسهال
شدید تری می شوند ( ٌ). از میان سروتیپ های اشریشیا کلی تولیدکننده ی وروتوکسین (EHEC) ، O157 و H7 شایع ترین می باشند(ُ). هدف این مطالعه بررسی حضور ژن های بیماریزای توکسین های stx1،stx2،ST،LT وهمچنین آنتی ژن های O157 وH7 که خاص پاتوتیپ های VTECوETEC است در عفونت های ادراری اشریشیا کلی است که توسط پاتوتیپ UPEC ایجاد می شوند.
مواد و روش ها
این مطالعه روی ًًَ نمونه اشریشیا کلی جداشده ازمبتلایان به عفونت ادراری مراجعه کننده
به مراکز درمانی در استان تهران با کلونی کانت CFU >100000 در هر میلی لیتر(بالاترین حد عفونت) پس از جداسازی و کشت بر روی محیط EMB وآگارخوندار انجام گرفت. سپس اشریشیا کلی بودن ایزوله ها با استفاده از تست های بیوشیمیایی IMVIC تایید گردید.
در مرحله بعدی با استفاده از روش DNA, Boiling کامل از باکتری ها استخراج گردید. تکثیر این ژنهای بیماریزا بوسیله پرایمر های اختصاصی آنها(جدول ٌ ) که در مطالعات پیشین
مورد استفاده قرار گرفته بود، انجام شد. واکنش PCR برای هر جفت پرایمر بطور مجزا
درحجم ٍِ میکرولیتر شامل ٍ یونیت آنزیم Taq ، بافر آنزیم ( ًِ میلی مولار کلریدپتاسیم ،ًٌمیلی مولارتریس،(pH=8.3،ٍ میلی مولارکلرید منیزیم، َ؟ً میلی مولار dNTPs ،ًٌ پیکومول هر یک از جفت پرایمرها و ًًٍ نانوگرم DNA طبق شرایط دمایی و زمانی ذکر شده در جدول ٍ انجام شد. جهت بررسی محصول PCR از الکتروفورز بر روی ژل آگارز (ٍ%) همراه با مارکر وزن ملکولی استفاده گردید.
جدول ٌ. مشخصات پرایمرها ی استفاده شده در این مطالعه و منبع آنها
جدول شماره یٍ. چرخه های دمایی و زمانی برای تکثیر ژن هایstx1،stx2،LT وST وآنتی ژن های O157 وH7
نتایج و بحث
در این تحقیق ًًَ نمونه E.coli جدا شده از بیماران مبتلا به عفونت ادراری مورد بررسی
قرار گرفت. نتایج تکثیر ژن ها در برخی از نمونه ها در شکل ٌ نمایش داده شده است. از میان
نمونه بررسی شده ًَ نمونه ( ًٌ%) حاوی ژن stx1 ،ٌَ نمونه (ّ %) حاوی stx2، ّ نمونه (ٍ%) حاوی ژن LT بودند و هیچ کدام از نمونه ها حاوی ژن ST نبودند. همچنین َنمونه (ٌ%) حاوی ژن آنتی ژن O157 وٌٍ نمونه (ْ%) حاوی ژن آنتی ژن H7 بودند. َ نمونه نیز بطور همزمان حاوی هر دو ژن stx1 و stx2 بودند
شکل ٌ. نتیجه تکثیر به ترتیب ازچپ به راست. نشانگر اندازه ًًٌ جفت بازی ، کنترل مثبت Stx1و Stx2، کنترل مثبت O157 وH7، کنترل مثبت LT وST، نمونه ی بالینی Stx1، Stx2، O157، H7 و .LT
عفونتهای اندام ادراری ( (UTI یکی از متداولترین عفونتهای باکتریایی است. ایجاد عفونت عمدتآً توسط پاتوتیپی از E.coli به نام UPEC ایجاد می گردد و سالانه هزینه زیادی صرف درمان آنها می گردد( ُ). همانند سایر باکتریها، سویه های مختلف E.coli علاوه بر یک مجموعه از ژنها که در فعالیتهای اصلی باکتری شرکت می نمایند ، بر حسب زیستگاه ، قادر به کسب یا از دست دادن
