بخشی از مقاله
چکیده
کلستریدیوم پرفرنجنس یک باکتری بی هوازی اسپوردار است که بر اساس ترشح توکسین های اصلی اش به پنج تیپ - A-E - تقسیم می شود. هدف از انجام این مطالعه بررسی حضور تیپ های مختلف کلستریدیوم پرفرنجنس در بز های کرکی رائینی استان کرمان است. بدین منظور جمعا" تعداد 271 نمونه بطور تصادفی از بزهای کرکی رائینی منطقه کرمان جمع آوری شد. بعد از آماده سازی نمونه ها و کشت، بر اساس ساختار کلنی های ایجاد شده، رنگ آمیزی و آزمون های بیوشیمیایی، کلنی ها تخلیص شد. درصد سویه های کلستریدیای جداشده 41/6 درصد بود. در مرحله بعدی جدایه ها با استفاده از روش Multiplex PCR برای حضور ژن های کد کننده توکسین کلستریدیوم پرفرنجنس مورد بررسی قرار گرفت. در جدایه ها، تیپ های A و B کلستریدیوم پرفرنجنس تشخیص داده شد. نتایج نشان داد که که تیپ A کلستریدیوم پرفرنجنس، تیپ غالب بود. همچنین با بررسی دندروگرام و قرابت اسید های نوکلئیک و درصد قرابت ژن القاء کننده توکسین آلفا کلستریدیوم پرفرنجنس جدا شده و سویه استاندارد مشخص شد که ژنوم توکسین آلفا کلستریدیوم پرفرنجنس جداشده با سویه استاندارد تشابه دارد.
کلمات کلیدی: کلستریدیوم پرفرنجنس، بز کرکی رائینی، ژنوتیپ، پی سی آر، تعیین توالی.
مقدمه
کلستریدیوم پرفرنجنس یک باکتری میله ای گرم مثبت اسپور دار بی هوازی است که باعث ایجاد بیماری در انسان و دام می شود. این باکتری قادر به تولید حداقل 17 نوع مختلف توکسین است که تمام آنها از جنس پروتئین می باشند. توکسینهای اصلی کلستریدیوم پرفرنجنس به آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا تقسیم می شوند که اساس طبقه بندی این باکتری به پنج تیپ A تا E است. تیپ های مختلف این باکتری عامل بیماریهای مختلفی است و حتی ممکن است یک تیپ بیماریهای متفاوتی را در میزبانهای مختلف ایجاد کند . - Ahsani et al., 2011; Alouf et al, 2006; Cato et al., 1986 - در بعضی آزمایشگاه ها جهت تعیین و تشخیص توکسین باکتری، از روش های مختلفی استفاده می شود اما واکنش زنجیره ای پلیمراز - PCR - یک تکنیک مولکولی است که در شرایط آزمایشگاهی قادر به تکثیرمقادیری زیادی از اسیدهای نوکلئیک است.
با توجه به اینکه در یک دام ممکن است تیپ های مختلفی از باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس باشد لذا برای تشخیص حضور تیپ های مختلف از روش Multiplex PCR استفاده شد. در این روش با استفاده از چندین نوع آغازگر متفاوت به طور همزمانمی توان حضور تیپ های مختلف را در یک نمونه شناسایی نمود . - Ezatkhah et al., 2016 - بزهای کرکی رائینی یکی از مهمترین دامهای تولیدکننده چهارمین سمینار ملی مدیریت پرورش دام، طیور و آبزیان و دومین جشنواره بز کرکی کرک هستند که بواسطه ارزش بالای کرک تولیدی و همچنین تراکم زیاد در جمعیت گلههای عشایری استان کرمان اهمیت اقتصادی خاصی دارند.
مواد و روشها
روش مطالعه از نوع توصیفی - Cross Sectional - است. حجم نمونه با در نظر گرفتن میزان آلودگی با حدود اعتماد - =0/05 - %95 محاسبه شد. از نمونه گیری تصادفی چند مرحلهای - Multistage random sampling - برای نمونه گیری استفاده شد. جمعا" 271 نمونه از بزهای کرکی رائینی در منطقه کرمان جمع آوری شد. بعد از آماده سازی نمونه ها، از سوسپانسون حاصل روی بلاد آگار کشت داده شد. پلیت های بلاد آگار کشت داده شده را درون جار قرار داده شد و محیط جار با استفاده از دستگاه انوکسومت مدل Mart بیهوازی شد. سپس پلیت ها به مدت 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. کلونی های ایجاد شده روی بلاد آگار از نظر نوع همولیز ایجاد شده و ساختار بررسی شدند. پس از تخلیص کلنی ها و تشخیص اولیه کلستریدیوم پرفرنجنس با آزمایشهای بیوشیمیایی، DNA آن استخراج گردید. واکنش Multiplex PCR بر روی استخراج ها و در میکروتیوپ های 0/5 میلی لیتری، با حجم 50 میکرولیتر انجام شد. ترکیبات واکنش حاوی DNA الگو، پرایمرها - جدول - 1، PCR Master Mix و آب عاری از نوکلئاز بود. میکروتیوپ ها در ترموسایکلر - مدل - Bio-Rad قرار داده شد. از برنامه استاندارد شده موسسه رازی، استفاده شد . - Ezatkhah et al., 2016 - جهت مشاهده نتایج، از ژل الکتروفورز 1/5 - درصد - استفاده شد. پس از اتمام الکتروفورز و رنگ آمیزی، عمل عکسبرداری از ژل انجام گردید. سپس طول قطعات تولید شده با مقایسه آغازگر ها تعیین شد. بعد از تایید قطعات تکثیر یافته و جهت مقایسه توالی نوکلئوتیدی و ترسیم دندروگرام - Dendrogram - و یا درخت فیلوژنی از روش Multiple Sequence Alignment و نرم افزارهای - Ver.:15.10 - Sequin و Clustal Omega - Ver .:1.2.2 - استفاده گردید.
نتایج و بحث
با توجه به نتایج آزمایش های جداسازی و آزمون های بیوشیمیایی و مقایسه با جداول مرجع، از مجموع نمونه های ارسالی حدود 41/6 درصد سویه های مختلف کلستریدیای جدا شد. جدایه ها با استفاده از روش Multiplex PCR برای حضور ژن های کد کننده توکسین کلستریدیوم پرفرنجنس مورد بررسی قرار گرفت. از نمونه های کلستریدیایی جداشده در آزمون های باکتریایی، تعداد 9 مورد از جدایه ها، بر اساس ژن کد کننده، کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ های A و B تشخیص داده شد در پژوهش - 2016 - Elsify et al. تعداد 300 نمونه از گوسفندان به ظاهر سالم و مشکوک به ابتلا به آنتروتوکسمی مورد ارزیابی باکتریایی و مولکولی قرار داده شد. میزان جداسازی با آزمون های باکتریایی به ترتیب معادل %12 و %59 گزارش شد. همچنین با استفاده از روش Multiplex PCR، %43 تیپ A، %42/7 تیپ D و %14/61 تیپ B تشخیص داده شد.
در پژوهش دیگری - 2007 - Gokce et al. گزارش کردند که مهمترین تیپ کلستریدیوم پرفرنجنس، تیپ های A و D میباشد و پیشنهاد دادند که واکسن های آنتروتوکسمی باید علیه این دو تیپ ایمنی ایجاد کنند. در پژوهش - 2005 - Greco et al. تعداد 100 راس گوسفند و بز از 25 مزرعه در ایتالیا که مشکوک به آنتروتوکسمی بودند، انتخاب شد. 25 سویه باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس جدا کردند که با روش Multiplex PCR، %84 تیپ A و %16 تیپ D تشخیص داده شد. در پژوهش Songer & - 1996 - Meer از 361 نمونه که از حیوانات اهلی و انسان جدا شده بود، %95 تیپ A گزارش کردند. این تفاوت ها بدین علت است که وجود و بروز هر تیپ به میزان بسیار زیادی به منطقه جغرافیایی وابسته است و در بعضی مناطق ممکن است بطور کلی یک یا چند تیپ از باکتری وجود نداشته باشد. همچنین تفاوت های آشکاری بین ژنوتیپهای مختلف وجود دارد که می تواند ناشی از اختلاف در منشاء جغرافیایی باشدمثلاً. گزارش شده است که در آمریکای شمالی تیپ A غالب است و تیپ C و D غیر معمول است. همچنین %97 سویه های جدا شده در بلژیک، تیپ A بودند. همچنین در دیگر کشور ها گزارشاتی از جداسازی تیپ E وجود دارد، اما تا کنون در ایران گزارشی نشده است . - Mainil, 2006 -
امروزه برای تشخیص و طبقه بندی میکروارگانیسمها ایجاد کننده بیماریها، استفاده از یک روش سریع شناسایی ژنوم رایج شده است . - Ahsani et al., 2010; Bartlett & Stirling, 2003 - روش های مولکولی علاوه بر داشتن حساسیت و اختصاصیت بالا نسبت به روشهای سابق مزیتهای زیادی دارد. با روش مولکولی از جمله PCR می توان دامنه وسیعی از ارگانیسمهای مورد نظر را شناسایی کرد . - Coetzer & Tustin, 2004 - اگرچه PCR یک روش ساده، موثر و اقتصادی برای تکثیر، تشخیص و تعیین ژنوتیپ DNA است ولی استخراج DNA یک مرحله وقتگیر است و کیفیت و کمیت DNA الگو میتواند تکثیر قطعات را در واکنش PCR تحت تأثیر قرار دهد.
برای دست یافتن به یک تکثیر رضایت بخش باید شرایط بهینه برای PCR فراهم شود . - Van Asten et al., 2009 - با بررسی دندروگرام و بر اساس قرابت اسید های نوکلئیک و درصد قرابت ژن القاء کننده توکسین آلفا کلستریدیوم پرفرنجنس جدا شده و سویه استاندارد مشخص شد که ژن توکسین آلفا کلستریدیوم پرفرنجنس جدا شده با سویه استاندارد تشابه داشته و قرابت نسبت به یکدیگر وجود دارد. توکسین آلفا با داشتن 370 اسید آمینه دارای فعالیت های بیولوژیکی می باشد و بیش از %75 از کل ژنوم القاء کننده توکسین آلفا در هر کدام از سویه ها تعیین توالی شد. علاوه بر این با تعدادی از ژن های که در بانک ژن ثبت شده است، قرابت ژنومی دارد. توکسین آلفا دارای فعالیت های فسفولیپازی و اسفنگومیلینازی می باشد که نکروز پوستی، همولیز و مرگ را سبب می
