بخشی از مقاله
چکیده
گروهی از قارچها از جمله قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس جزء قارچهای توکسینزا بوده که توانایی تولید توکسین بر روی بسترهای مختلف از جمله بذور و مواد غذایی را دارند، در این پژوهش قارچ موردنظر بعد از خالصسازی بر روی محیط کشت PDA بر روی دو بستره پسته و برنج کشت داده شد و سپس توکسین موردنظر استخراج و با استفاده از روش HPLC و TLC مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص گردید
این قارچ توانایی تولید چهار نوع آفلاتوکسین B1، B2، G1 و G2 را دارد و با تولید 2/32 میکروگرم در سیسی سم آفلاتوکسین نسبت به کشت بر روی پسته که 1/45 میکروگرم در سیسی تولید کرد، مقدار بیشتری توکسین تولید میکند؛ بنابراین بااطلاع از توانایی بالای این قارچ در تولید توکسین بر روی پسته و بخصوص برنج میتوان از پیامدهای ناشی از آن جلوگیری و پیشگیری کرد و یا از سموم تولیدی توسط این قارچ جهت انجام کارهایه تحقیقاتی استفاده نمود.
.1مقدمه
آفلاتوکسینها تشکیل یک گروه اپوکساید در موجودات خون گرم، سمیت حاد و مزمن ایجاد میکند و حیواناتی که قادر به تولید آن نیستند درمقابل بروز هر دو نوع سمیتنسبتاً مقاوم میباشند .اپوکساید آفلاتوکسین B1 بهصورت اختصاصی با دنبالههای گوانین مولکولهای DNA در تعدادی از نقاط فعال واکنش میدهد که یکی از این نقاط کدون 249 در ژنP53 میباشد .محصول این ژن در فرآیندی که بهطور طبیعی موجب محافظت در برابر سرطان میشود، شرکت مینماید.
آفلاتوکسینها متابولیتهای قارچی هستند که توسط سویههای قارچ آسپرژیلوس - Aspergillus Parasiticus و - A.Flavus تولید میشوند. این سموم قارچی که ممکن است در مواد خوراکی قبل از برداشت، بین مرحله برداشت و خشککردن و در انبار و یا بعد از فرآیند در کارخانهها در شرایط مطلوب درجه حرارت و رطوبت تولید شوند، موجب تضعیف سیستم ایمنی، مسمومیت کبدی، موتاسیون، سرطانزایی، ناقص الخلقهزایی و خونریزی میشون
غلات، دانههای آجیلی و روغنی با دارا بودن چربی و کربوهیدرات بالا، از مستعدترین محصولات کشاورزی و خشکبار برای آلودگی به کپکها و تولید آفلاتوکسین به شمار میروند .بادامزمینی، پسته، گندم، برنج، ذرت، بادام و انجیر از مهمترین میزبانان این قارچ هستند و بهعنوان مناسبترین بستر طبیعی برای رشد قارچهای آفلاتوکسیزا در جهان شناختهشدهاند .تاکنون چندین نوع آفلاتوکسین شناساییشده است که از بین آنها آفلاتوکسین B1,B2,G1,G2 از بیشترین اهمیت برخوردار هستند
تمام مواد اولیه غذایی، استعداد آلودگی به مایکوتوکسینها و قارچهای مولد آنها رادارند؛ اما مواد غذایی نظیر ذرت، بادامزمینی، پسته، انگور، برنج، میوههای خشک، انواع ادویهجات، دانههای روغنی گندم، جو و بهطورکلی غلات و حبوبات در این رابطه از اهمیت بیشتری برخوردار میباشند
برنج نیز مانند سایر غلات در معرض آلودگی به قارچها بوده و میتواند محلی مناسب برای رشد قارچهای توکسین زایی همچون آسپرژیلوس باشد. تحقیقات، نشان داده است که تولید آفلاتوکسین در برنج به واریته و مراحل رسیدگی بستگی دارد .آسپرژیلوس فلاووس، از بیشتر واریتههای برنج جداشده، ولی سایر گونههای مولد آفلاتوکسین مانند آسپرژیلوس پارازیتیکوس و آسپرژیلوس نومیوس، در تعداد کمی از آنها دیدهشده است
با توجه به اهمیت دو محصول برنج و پسته و آلودگی آنها در شرایط رشدی و انبارداری آنها به قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس، شناخت چگونگی بررسی توکسینزایی این قارچ بر روی این محصولات میتواند راهگشای تحقیقات بیشتر در این زمینه و بررسی آفلاتوکسین سرطانزای آن باشد.البته ناگفته نماند که گونه غالب توکسین زا بر روی محصولی مثل پسته آسپرژیلوس فلاووس است و برسی توکسین زایی روی بستر پسته بیشتر باهدف انتخاب بستر مناسب جهت توکسینزایی قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس بوده که توکسین استخراجشده آن به لحاظ کارهای تحقیقاتی و تجاری کاربردهای فراوان دارد.
.2مواد و روش
خالص سازی قارچ
ایزوله قارچ Aspergillus parasiticus Speare S286 باقابلیت توکسینزایی از مرکز پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه گردید و از ایزولههای قارچی با استفاده از آب مقطر استریل سوسپانسیون تهیه شد و این سوسپانسیون در زیر هود و در شرایطکاملاً استریل روی محیط کشت آبآگار مخطط گردید. تک اسپورهای جوانهزده بعد از 12 تا 18 ساعت به تشتک پتری ولولههای آزمایش حاوی محیط کشت شیبدار PDA انتقال داده شدند. کشتهای درون لوله و پتری بعد از 4 تا 5 روزرشد در محیط انکباتور به یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد انتقال داده شدند.
آمادهسازی بستره برنج و پسته
مقدار 100 گرم برنج و پسته بهطور جداگانه در ارلن مایر جداگانه ریخته شد و به نسبت 100 به 27 به هرکدام از بسترهها آب مقطر استریل اضافه گردید. این بسترهها در شرایط دمایی 121 درجه سانتیگراد و فشار 1/5 اتمسفر به مدت 15 دقیقه در دستگاه اتوکلاو ضدعفونی گردید و 24 ساعت بعدمجدداً اتوکلاو گردیدند تا کلیه عوامل خارجی آن از بین برود.
تلقیح قارچ به بسترههای کشت
بعد از خالصسازی قارچ، این قارچ بر روی محیط کشت PDA گسترش داده شد و سپس سوسپانسیون اسپوری به غلظت 106 1 در آب مقطر تشکیل داده شد و مقدار 10 سیسی از این سوسپانسیون در شرایط کاملاً استریل در زیر هود لومینار به بسترهها اضافه گردید و ارلنهای حاوی تیمارهای اعمالشده در دمای معمولی اتاق و در شرایط 24 ساعت نور و تاریکی قرار گرفتند.
استخراج توکسین
بهمنظور استخراج زهرابههای قارچی ابتدا محتویات ارلنها به مدت 24 ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و سپس روی نمونههای آسیاب شده بذور آلوده استونیتریل - متانول اضافه شد و سپس به مدت 3 ساعت روی شیکر قرار داده شدند. مخلوط حاصل با کاغذ صافی واتمن صاف گردید و عصاره در فالکونهای تمیز جمعآوری شدند و عصاره حاصل از ستون تصفیه حاوی رزین کاتیونی و مخلوط آلومینا – کربن عبور داده شدند.
به این منظور ابتدا و انتهای ستون با یکلایه پشمشیشه مسدود و بر روی آنیک گرم مخلوط آلمونیا – کربن اضافه میگردد و دوباره یکلایه پشمشیشه مسدود روی آن قرار میگیرد و سپس رزین کاتیونی که از قبل به مدت 1 ساعت در آب مقطر قرارگرفته است در ستون ریخته و بعدازآن عصاره نمونهها از ستون عبور داده شدند. عصاره عبور دادهشده ستون اول با استفاده از ستون تصفیه دوم شامل به ترتیب پشمشیشه و آلومینا-کربن و پشمشیشه مجدداً خالص میشود و سپس عصاره عبور دادهشده از ستون تصفیه دوم برای تبخیر حلال به آون 70 درجه سانتی منتقل میگردد.
پس از خشک شدن عصاره استخراجشده محلول متانول-آب به آن اضافه میگردد و به مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار میگیرد سپس محلول متانول-آب و محلول استونیتریل- متانول نیز به آن افزوده گردید و بهمنظور تبخیر مجدد حلال دوباره در آون با دمای 70 درجه سانتی قرار میگیرد و درنهایت به عصاره خشکشده، محلول متانول-آب اضافه شد و عصارههای استخراجشده در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند
بررسی توکسینزایی به روش TLC
بعد از استخراج سموم، محلولهای نمونه و استاندارد افلاتوکسین بر روی صفحه TLC - صفحه آلومینیومی TLC همراه با سیلیکا ژل - . در یک راستا نقطهگذاری شدند، بعدازاینکه صفحه در مخزن TLC قرار داده شد و محلول متانول: استونیتریل - 12 : 88 - از آن بالا رفته و صفحه شسته میشود. صفحه را در هوا خشک کرده، تحت نور لامپ - nm 365 - UV مورد قضاوت قرار داده میشود و شدت نقطه فلورسانس آبی نمونه با نقطه فلورسانساِستاندارد مقایسه میشود
بررسی توکسینزایی به روش HPLC
بهمنظور تجمع بیشتر افلاتوکسینها، عصاره بهدستآمده به ستون ایمونوافیمنیتی متعلق به .Biopharm Rhan Glasgow UK با قطر داخلی ذرات 0/5 میلیمتر وارد شد که به دلیل داشتن آنتیبادیهای سطحی درروی ذرات، ابتدا افلاتوکسینها را نگهداری کرده و سپس با عبور متانول، از ستون خارجشده و آب دیونیزه اضافه گردید. برای سنجش کمی افلاتوکسینها از دستگاه HPLC استفاده شد
بدین منظور 20 میکرو لیتر عصاره به ستون کروماتوگرافی فازمعکوس C18-Supelco Discovery به طول 25 سانتیمتر. قطر داخلی 4/5 میلیمتر و قطر ذرات 5 میکرومتر متصل به دستگاه Unicam-Crystal-200 ساخت انگلستان تزریق گردید. فاز متحرک شامل مخلوط استونیتریل - %20 - ، متانول - %20 - و آب دیونیزه - %60 - میباشد که با سرعت 1 میلیلیتر بر دقیقه از ستون عبور مینماید.
دتکتور از نوع فلورسانس در طولموج تحریکی 365 نانومتر و طولموج خروجی 445 نانومتر تنظیم گردید و بهمنظور تقویت فلورسانس افلاتوکسینها از ستون مشتقساز تولیدکننده برم PB.PB با قطر ذرات داخلی 0/5 میلیمتر متعلق به Uk.Biopharm Rhan Glasgow استفاده شد. هرکدام از انواع افلاتوکسینها بر اساس مطابقت پیک خروجی بازمان بازداری پیک استاندارد و بر اساس غلظت نمونه استاندارد تعیین هویت و غلظت گردید
.3نتایج و بحث
نتایج نقطهگذاری بر روی صفحه TLC مشخص کرد نمونههای آفلاتوکسین استخراجی از روی بستره برنج بعد از نقطهگذاری شدت فلورسانس بیشتری از خود نشان میدهد و نور بازتابیده از آن بیشتر و حتی اندازه نقاط بزرگتر میباشد
