بخشی از مقاله
مقدمه
قبل از شناسایی و معرفی روش های نوین کار با مارکرهای مولکولی در ارزیابی روابط بین ژنوتیپ ها در یک گونه خاص غالباً صفات مورفولوژیک نقش عمده را ایفا می نمودند. اخیراً علم بیوتکنولوژی کمک شایانی در تشخیص روابط ژنتیکی و فیلوژنی در اصلاح گیاهان نموده است. نشانگر های مولکولی و صفات مورفولوژی هر دو می توانند تکمیل کننده یکدیگر باشند و نمی توانند به تنهایی ابزار مفید و سودمندی در متدهای مختلف اصلاحی محسوب شوند. گزارشات مختلف مبنی بر ارتباط توام صفات مورفولوژی و مولکولی با استفاده از روش های آماری بیان شده است(٣،٢،١و٤). یو
و همکاران(٨) ارتباط بین صفت مقاومت به بیماری بلایت باکتریایی در لوبیا زراعی، با ژنوم این گیاه را توسط مارکر مولکولی RAPD بررسی کردند. در این میان با انجام تجزیه رگرسیون مرحله ای دو مارکر eAAEmCAG183 و eAAEmCAG333 در مجموع میزان ١/١۵ درصد از تنوع فنوتیپی را توجیه نمودند و نهایتاً همبستگی بالایی بین ژنوم گیاهی و صفت مقاومت به بیماری باکتریایی با این مارکر را گزارش دادند.
ویرک و همکارن(۶) با انجام آزمایش روی ٧۴ رقم زراعی برنج آسیایی و بکار گیری ٣۶ پرایمر چندشکل RAPD تعداد پنجه در بوته را تا ٠۵/٠ گلدهی مورد ارزیابی قرار دادند. تجزیه رگرسیونی نشان داد که ۵٨/٠ از تنوع برای تعداد پنجه
و کل تنوع برای زمان ٠۵/٠ گلدهی که در آن مجموعه های مارکر RAPD به عنوان متغیر مستقل در نظر گرفته شده را توجیه مینماید.
مواد و روشها:
در این آزمایش از شش رقم نیشکر مشتمل بر واریته های تجاری که به طور وسیع درمنطقه خوزستان کشت می شوند و برخی از واریته های امید بخش که کارهای تحقیقاتی روی خصوصیات زراعی ، عملکرد و بیماریها در حال انجام است، استفاده شد. در ابتدا صفات کیفی در شرایط مزرعه باتوجه به صفات مورفولوژیک کیفی که عبارتند از : طرز قرار گیری برگ، چسبندگی غلاف ساقه ، رنگ برگ، حالت مومی ساقه، شکل میانگره ساقه، ترک چوب پنبه ای و رنگ ساقه انجام شد. بعد از این مرحله DNA ژنومی از ٣- ٥/١ گرم برگ جوان، بر اساس روش تغییر یافته CTAB استخراج شد. کیفیت DNA استخراج شده به کمک الکتروفورز ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت. واکنش زنجیره ای پلی مراز بر اساس روش ویلیامز و همکاران (٧) با تغییر جزئی در ٢٥ میکرولیتر مخلوط واکنش شامل μ L٥/٢، x١٠ بافرPCR ، μM٢٠٠ dNTPs، ng١٥ آغازگر ٧/٠ واحد Tag DNA Polymerase و ng٥٠ از DNA الگو بود. تکثیر در دستگاه ترموسایکلر (اپندرف) که برای ٤٥ سیکل برنامه ریزی شده بود صورت گرفت. فراورده های تکثیر توسط الکتروفورز ژل آگارز ٢/٠١/٠ حاوی اتیدیوم بروماید x٥ /٠ بافر TBE از یکدیگر تفکیک شدند. پس از الکتروفورز فراورده های تکثیر در نور UV توسط gel doc عکس برداری شد. ژنوتیپ ها برای حضور (١) وعدم حضور(٠) امتیاز بندی شدند. بعد از این دو مرحله قلمه هایی از ارقام مورد نظر تهیه شده و پس از ضد عفونی با سموم قارچکش قلمه ها را به گلخانه انتقال داده و به قطعات تک جوانه ای تقسیم شدند. سپس این قطعات در گلدانهای پلاستیکی کشت شدند. آزمایش به صورت فاکتوریل با طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی اصفهان انجام گردید. پس از جوانه زنی و سبز شدن قلمه ها گیاهانی که دو برگ کامل داشتند و از لحاظ ظاهری مشابه هم بودند به محیط هیدروپونیک حاوی محلول غذایی منتقل شد . محلول غذایی براساس روش تانیمو وهمکاران تهیه گردید(۵). هر واحد آزمایش یک ظرف پلاستیکی ٧ لیتری درب دار بود که در آن ٥ /٥ لیتر محلول غذایی جای گرفت. این آزمایش دو فاکتور داشت، تیمار شوری با سه سطح (٠٥/٠و٢٥ /٠درصد) نمک NaCl و رقم با شش سطح فاکتورهای مورد استفاده بودند. در طول آزمایش ٣٠ صفت مختلف برای کشت هیدروپونیک مورد بررسی قرار گرفت که از میان این صفات: وزن خشک ساقه چه، وزن خشک برگ، وزن خشک اندام هوایی، وزن خشک کل، نسبت وزن خشک اندام هوایی به ریشه، ارتفاع، تعداد پنجه در هرگیاه، سطح برگ، سدیم برگ، پتاسیم برگ، کلر برگ و کلسیم برگ به صورت دلخواه انتخاب وبا داده های حاصل از نشانگر ملکولی RAPD تطبیق داده شدند . داده های حاصل از کار با مارکر مولکولی RAPD بعد از یکنواخت سازی به کمک نرم افزار NTsys 2.02 تجزیه و تحلیل شدند و محاسبات آماری خصوصیات کیفی و صفات حاصل از کشت هیدروپونیک به کمک نرم افزار SAS انجام شد.
ارتباط نشانگر مولکولی RAPD با صفات مورفولوژی کیفی و نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی و فیزیولوژی کشت هیدروپونیک برای هر صفت به صورت مجزا انجام شده است. در این مرحله برای تمام صفات رگرسیون به روش Stepwise انجام شد. در مدل مورد نظر صفات بررسی شده به عنوان متغیر تابع و داده های مولکولی (١و ٠) به عنوان متغیر ثابت وارد مدل رگرسیونی شدند. با توجه به صفات وارد شده به مدل، باندهایی که مقدار R2 بالایی داشتند مورد بحث و بررسی قرار گرفتند.
نتایج و بحث:
در بررسی مولکولی از ٦٥ آغازگر مورد استفاده ٣٠ آغازگر تولید الگوهای نواری چندشکل واضح نمودند و مجموعا ٣٨٣ باند تشکیل شد. تعداد نوارهای چند شکل ٢٥٦ عدد و تعداد نوارهای مونومورف ١٢٧ عدد می باشد، که مجموعاٌ ٨٤/٦٦ درصد چندشکلی مشاهده شد. در مرحله بعد رگرسیون مرحله ای با استفاده از نرم افزار SAS انجام شد. به ترتیب و به صورت مجزا داده های مولکولی با داده های حاصل از صفات کیفی مورفولوژیک وارد مدل شدند، تا باندهایی که بالاترین ضریب تشخیص را دارند مشخص شوند. اولین صفت کیفی فرم قرار گرفتن برگ است که نوار ٦٥ با ضریب تشخیص ٨٦/٠ بالاترین توجیه کننده ایستادگی برگ شد. دومین صفت، چسبندگی غلاف به ساقه است که نوار ٤٥٥ با مقدار R2 برابر با ۵٧ /٠ دارای ارتباط نزدیکی با این صفت بود. صفت سوم ترک چوب پنبه ای است که نوار ٢٣٢ به میزان ٩٢/٠ بالاترین R2 را به خود اختصاص داد و بیانگر اصلی صفت مورد نظر بود. صفت بعدی فرم ساقه است که نوار ٤٩ بالاترین ضریب تشخیص را داشت و به صورت ١٠٠ درصد ژنوتیپ فرم ساقه راتوجیه نمود. در ادامه کار نوار ٤٩٦ با رنگ برگ (٨٦ /٠(R2= و نوار ٢٣٢ با مومی بودن ساقه (٨٦/٠(R2= رابطه نزدیک و قابل توجهی داشتند(جدول١). در مرحله بعد صفات بررسی شده در کشت هیدروپونیک همانند صفات کیفی وارد مدل شدند و R2هایی که بالاترین ضریب تشخیص را داشتند برای هر صفت مشخص شدند جدول(٢).
با توجه به موارد ذکر شده و نتایج مندرج در جداول می توان استنباط نمود که رابطه زیادی بین هر کدام از صفات مورفولوژی و باندهای تشکیل شده توسط پرایمرهای خاصRAPD وجود دارد. پیشنهاد می شود در مطالعات بعد با بکارگیری پرایمر های معرفی شده در جداول مذکور ، قسمتهایی از ژنوم که ارتباط نزدیک با صفت مورفولوژی مورد مطالعه دارند، با تکنیک های مولکولی ویژه حدا شده و در مطالعات مولکولی از جمله آنالیز QTL استفاده شود. با این روش، ابزارهای مناسبی برای اصلاح نباتات در نیشکر بدست می آید.
