بخشی از مقاله
بررسي روشهاي تثبيت آنزيم ها، ويژگيها و مزايا
چکيده : آنزيمها کاتاليزورهاي چند کاره اي هستند که در زمينه هاي مختلفي نظير صنايع غذايي، داروسـازي، شـيمي و غيـره بطـور گسـترده اي مـورد استفاده قرار مي گيرند. براي گسترش کاربرد آنها در آزمايشگاهها و صنايع ،همچنين براي اطمينان از استفاده مجـدد از آنهـا در توليـد، نيـاز بـه افـزايش پايداري آنزيم است . تثبيت ميتواند موضوع ناپايداري آنزيمي را حل کند. مزاياي چشمگير آنزيمهاي تثبيت شده از قبيل پايـداري بيشـتر آنـزيم ، امکـان استفاده چندباره از يک منبع آنزيمي و جداسازي آسان آن از مخلوط واکنش سبب جلب توجه محققان در جهت گسترش روشهاي تثبيـت و اسـتفاده از آنزيمهاي تثبيت شده گرديده است . اصلي ترين روش هاي تثبيت آنزيمها عبارتند از: تثبيت از طريـق جـذب غيـر کووالانسـي، فعـل و انفعـالات يـوني، اتصالات کووالانسي، اتصالات عرضي بين آنزيمها و به دام انداختن در يک ژل پليمري يـا کپسـول مـيباشـند. در ايـن مقالـه انـواع روشـهاي تثبيـت بـا خصوصيات آنها بيان شده است .
واژه هاي کليدي: تثبيت ، آنزيم ، حامل هاي آنزيمي
1
مقدمه :
آنزيم ها ترکيبات نسبتا ناپايداري هستند که هزينه خالص سازي آنها بالاست و زمانيکه بصورت محلول در واکنش ها مورد استفاده قـرار ميگيرنـد، بازيافت آنها از مخلوط واکنش بسيار مشکل خواهد بود. مشکل اصلي آنها، حساس و شکننده بودن آنها نسبت به شرايط سخت محيطي اسـت کـه منجـر به اين امر ميشود که نيمه عمر عملکردي آنزيم کاهش بيابد. بهترين و موفق ترين روش براي غلبه بر اين مشکل ، تثبيت آنزيم است (١).
آنزيم تثبيت شده در مقايسه با آنزيم آزاد بدليل برخورداري از مزاياي چشمگيري مانند، پايداري بيشتر ، کاربرد پيوسته آنزيم ، بازيـابي آنـزيم ، حجـم کمتر واکنش ، کنترل بهتر و بازدهي بالاتر واکنش ، خلوص بيشتر محصول ، کاهش آلودگي محيط ، صرفه اقتصادي و استفاده از بيوکاتاليسـت تثبيـت شده در گستره وسيعي از انواع بيوراکتورها روز به روز مورد توجه بيشتري قرار ميگيرد (٣).
در يک تثبيت کارآمد بايستي فاکتورهاي متفاوتي را در نظر گرفت تا ضمن دستيابي به بهترين توازن بين ميزان پايداري و فعاليـت ، فرآينـد بـا کمتـرين هزينه ممکن انجام پذيرد. امکان تثبيت آنزيمها با حاملهاي مختلف ، توسط روشهاي مختلفي صورت ميگيرد. معمولا ارجحيت با روشي است که کمتـرين صدمه را به آنزيم وارد ميکند و در اين ميان سيستمهايي با سهولت و امنيت بيشتر و هزينه کمتر ايده آل ميباشند و روش محبوس کردن تا حـد زيـادي اين نياز را در غالب موارد تامين ميکند. اين مقاله بر اساس پژوهش هاي انجام شده توسط محققين مختلف ،اهميـت و انـواع روشـهاي تثبيـت آنزيمهـا را بيان مي نمايد.
هدف از تثبيت ، افزايش مقاومت آنزيمي را در شرايط شديد درجه حرارت ، pH و حلالهاي آلي، بازيافت و استفاده مجدد از آنزيم است . با وجود اين مزايا، کاربرد صنعتي آن به دليل هزينه هاي بستر، محدوديت هاي انتقال جرم ، نگرش سنتي، تغيير در خواص (عملکرد اختصاصي )، از بين رفتن فعاليت در طي تثبيت محدود شده است .
انواع روش هاي تثبيت :
امکان تثبيت آنزيمها با حاملهاي مختلف توسط روشهاي، مختلفي صورت ميگيرد. معمولا ارجحيت با روشي است که کمترين صـدمه را بـه آنـزيم وارد ميکند و در اين ميان سيستمهايي با سهولت و امنيت بيشتر و هزينه کمتر ايده آل ميباشند و روش محبوس کردن تا حد زيادي ايـن نيـاز را در غالـب موارد تامين ميکند.
اغلب روشهاي تثبيت به پنج دسته تقسيم ميشوند که هر کدام مزايا و معايب خود را دارند:
١. تثبيت با جذب غير کووالانسي
٢. تثبيت از طريق فعل و انفعالات يوني
٣. تثبيت با اتصالات کووالانسي
٤. تثبيت بوسيله اتصال عرضي آنزيمها
٥. تثبيت به وسيله به دام انداختن در يک ژل پليمري يا کپسول
١.تثبيت با جذب غير کووالانسي: جذب آنزيم بر روي حاملها ميتواند بوسيله انواع مختلفي از فعل و انفعالات گيرد. آنزيمهـاي داراي سـطوح ليپوفيـل بالا اتصال خوبي با يک حامل هيدروفوب ايجاد ميکنند. نيروهاي واندروالسي و تغييرات آنتروپي، تثبيت آنزيم بر روي حامل را تضمين ميکند.باقيمانـده - هاي قندي آنزيمهاي گليکوزيله شده ميتواند جذب از طريق پيوندهاي هيدروژني را اطمينان بخشد ومنـاطق سـطحي هيـدروفيليک زيـادي از آنـزيم بـا حامل هيدروفيل واکنش ميدهند(٧). مزيت تثبيت بوسيله تاثيرات آنتروپي يا پيوندهاي هيدروژني اينست که آنزيم پيش تيمار نشده و از نظر شـيميايي تغيير نميابد. همچنين امکان استفاده از آنزيم خام در اين نوع تثبيت ها وجود دارد. تغيير شرايط تثبيـت بـه مقـدار زيـادي نتـايج را تغييـر ميدهـد و در نتيجه ميتواند دستکاري مستقيم آنزيم را ممکن سازد(٥).
عيب مهم تثبيت توسط جذب سطحي اينست که آنزيم تمايل به نشت از حامل را هنگام استفاده در محيط هاي آبي دارد.اگـر حـلال هـاي آلـي اسـتفاده شود، بدليل ماندگاري ذاتي آنزيم ها در چنين محيط هايي، اين موضوع حائز اهميت نيست .
٢.تثبيت از طريق فعل و انفعالات يوني: بسته به pH و نقطه ايزوالکتريک محلول ، ممکن است سطح آنزيم داراي بار باشد. با بکارگيري سيستم هـاي مدل سازي مي توان توزيع و بار سطحي آنزيم ها را تعيين نمود(٦). هر مبدل يوني مي تواند از طريق واکنشهاي قطبـي و يـوني بعنـوان يـک حامـل در تثبيت آنزيم ها عمل کند. بسته به بار اصلي آنزيم ، مبدلهاي يوني بصورت منفي (نظير کربوکسيلات ) يا مثبت (گروههاي آميني پروتـون دار) بـاردار مـي شوند.فعاليت و قابليت عملکرد انتخابي آنزيم ها بسته به pH و دماي بکار رفته در تثبيت متفاوت مي باشد که اين امـر بـدليل يونيزاسـيون آنـزيم حـين فرايند تثبيت است .
مثالي از اين نوع تثبيت آنزيم بنزآلدئيد لياز ميباشد از طريق کمپلکس ايميدازول و نيکل متصل به پليوينيل پيروليدون بعنوان ماتريکس تثبيت شده و مي تواند چندين بار براي تشکيل بنزوئين مورد استفاده قرار گيرد.
2
شکل ١: آنزيم بنزآلدئيد لياز بهمراه زنجيره اش از طريق حامل اصلاح شده با نيکل تثبيت شده و تشکيل بنزوئين را کاتاليز مي نمايد.
نقش ساختارهاي متخلخل سيليکات در عمل تثبيت : سيليکاتهاي متخلخل نيز از پيش ساز سيلان بـا اسـتفاده از سـورفاکتانت ، سـنتز شـده کـه ايجـاد ساختاري متخلخل با توزيع اندازه منافذ باريک مي نمايند. قطر منافذ از طريق انتخاب نوع سورفاکتانت و شرايط آزمـون از ٢ تـا ٢٥ نـانومتر متغيـر مـي باشند اين ساختارهاي متخلخل سيليکات امکان جذب و يا به دام انداختن مولکولهاي زيستي بزرگي را درون منافذ فراهم مي آورند. بسته بـه بـار آنـزيم ، گروههاي عملگرا نظير آمين و کربوکسيلات درون ساختار جهت تسهيل جذب آنزيم با حفظ فعاليت آن افزوده مي شوند. ايـن گروههـا بايسـتي بـا قطـر دهانه منافذ سيليکات متناسب بوده تا امکان عملکرد مناسب سيليکات در جذب و حفظ آنزيم فراهم شود(١١).
ساختار متخلخل تامين کننده محيطي محافظ و پوششي براي آنزيم بوده و در آنجا واکنش آنزيم با سوبستراهاي انتخابي با بـه حـداقل رسـيدن معـايبي نظير پراکندگي انجام مي گيرد. بعنوان مثال استفاده از تريپسين تثبيت شده در سيليکاتهاي متخلخل براي هضم مقداري از پروتئين ها صـورت و نفـوذ سوبسترا درون منافذ با محدوديت همراه نگرديد. همچنين در تحقيقـي ديگـر آنـزيم کلروپراکسـيداز بـر سـيليکات متخلخـل تثبيـت و نقـش حفـاظتي سيليکات بعنوان يک عامل نگهدارنده بررسي گرديد. اين آنزيم اکسيداسيون گروههاي عملگراي بسياري نظير اپواکسيداسـيون آلکـن هـا را کاتـاليز مـي نمايد (٨).
٣.تثبيت با اتصالات کووالانسي: پيوند کووالانسي آنزيم به حامل داراي ايـن مزيـت اسـت کـه آنـزيم بصـورت محکمـي ثابـت و بـدين شـکل امکـان شستشوي آن در محيط آبدار به حداقل رسيده و آلودگي پروتئيني محصول روي نمي دهد.
در قالب يک قانون کلي، تثبيت کووالانسي بايستي هنگام کار در محلول آبدار و زمانيکه عوامل دناتوره کننده وجـود دارنـد تـرجيح داده شـود. دليـل آن تشکيل چندين پيوند کووالانسي بين آنزيم و حامل و کاهش انعطاف پذيري و ارتعاشـات حرارتـي حامـل و همچنـين ممانعـت از بـاز شـدن پـروتئين و دناتوراسيون مي باشد (٣،٥).
مزيت ديگر، بطور کلي آنزيم هاي تثبيت شده بصورت کووالانسي را مي توان در هر محيطي بکـار بـرد در حاليکـه آنـزيم هـاي جـذب شـده بايسـتي در حلالهاي آلي يا در واکنش دهنده هاي هيدروفوبيک خالص جهت ممانعت از شستشه شدن مورد استفاده قرار داد (٥).
عيب آشکار پيوند کووالانسي اين است که آنزيم به لحاظ شيميايي دچار تغيير گشته و همچنين تثبيت يکنواخت و منظمي براي همه مولکولهـاي آنـزيم رخ نمي دهد عليرغم اينکه اتصال چند نقطه اي آنزيم ها مي تواند سبب پيوند محکم آنها به حامل گردد. اين عامل محدود کننده تنها براي آنـزيم هـاي مونومري نمي باشد بلکه انواع مولتي مري را نيز شامل مي شود.
٤.تثبيت بوسيله اتصال عرضي آنزيمها: يک مورد پرکاربرد از اتصال کووالانسي، اتصال عرضي آنزيم ها با بکارگيري عـواملي نظيـر گلوتارآلدئيـد مـي باشد. به جاي تثبيت يک آنزيم به يک حامل ، آنزيم ها خود بعنوان يک حامل عمل مي کنند. مرحله نخست ، تهيه کريسـتال هـا يـا تـوده هـاي آنزيمـي بشکل خشک شده به روش پاششي مي باشد. با اين روش آنزيم هاي موجود در محلول را نيز مي توان اتصال عرضي نمود (٩).
در اين روش آنزيم تثبيت شده فاقد حامل بوده و همانند آنزيم خالص فاقد مزايا و معايب مرتبط با حامل ها مي باشد. افزودن ترسيب دهنده هايي نظيـر
استن ، سولفات آمونيوم ، اتانول و يا ١و٢ دي متوکسي اتان در پي يک عامل اتصال عرضي دهنده نظير گلوتارآلدئيد انجام مي شود.
شکل ٢: متراکم شدن و اتصال عرضي آنزيم ها براي ايجاد يک CLA يا همان توده هاي آنزيمي اتصال عرضي شده
ليپاز BCL با سرم آلبومين گاوي بعنوان عامل پشتيبان و در حضور دکسترين اتصال عرضي مي شود که تـوده هـاي حاصـل نسـبت بـه نـوع تجـاري و معمولي آن و همچنين از ژل خشک ليپاز فعاليت بيشتري را دارا مي باشند.
3
يک کاتاليست بايستي پس از واکنش بدون تغيير باقي مانده و قابليت بازيابي مجدد را دارا باشد که در مورد توده هـاي آنزيمـي اتصـال عرضـي شـده رخ نمي دهد.
٥.تثبيت به وسيله به دام انداختن در يک ژل پليمري يا کپسول : بهترين ابزار براي ممانعت از هر گونه تاثير منفي بر ساختار يک آنـزيم انکپسـوله نمودن آن است . روشهاي زيادي براي اين عمل وجود دارند که در اين بين روش سل _ژل بهتـرين و پرکـاربردترين روش مـي باشـد. سـل _ژل هـا مـواد سيليکايي بوده که بسيار متخلخل و بسهولت تهيه مي شوند. سل _ژل ها به لحاظ شيميايي خنثي و پايداري مکانيکي و حرارتي بالايي دارند اما بصـورت طبيعي شکننده مي باشند. اين مواد بصورت گستره در تثبيت پروتئين ها و بخصوص در توليد بيوسنسورها مورد استفاده قرار مي گيرند (١٢).
يک کاتاليزگر در طي واکنش ، سرعت رسيدن به تعادل را بدون اينکه در واکنش مصرف شود، افزايش ميدهد. با اين تعريف يک کاتاليزگر بايد قابل بازيافت باشد. اگر يک کاتاليزگر، آنزيم و يا نوع ديگري از کاتاليزگر، در محيط واکنش حل شود، اغلب بازيابي آن دشوار است ، چه رسد به استفاده مجدد از آن . تثبيت يک کاتاليزگر ميتواند يک راه ساده بازيافت کاتاليست باشد (١٠).
بسياري از آنزيمها بصورت تجاري در دسترس هستند. قيمتها بسته به درجه سختي جداسازي آنزيم و يا آساني بدست آوردن آنها از منابع نوترکيب ميتواند بصورت قابل توجهي متفاوت باشند. بعضي از آنها به قدري ارزان هستند که در پودرهاي شوينده و کاربردهاي فله اي ديگر استفاده ميشوند.
آنزيمها حساس ، ناپايدار و قابل استفاده در محيط آبي هستند که اين ويژگيها براي يک کاتاليزگر، غير ايده آل و در بسياري از سنتزها نامطلوب است .
در بسياري از موارد، يکي از راه هاي جلوگيري از اين مشکلات ، تثبيت آنزيم است . از آنجا که تثبيت آنزيم امکان فرآوري متناوب در کاربرد در مقياس - هاي صنعتي را ايجاد ميکند، راه مناسبي است . بوسيله تثبيت ، آنزيمها پايدار شده و در نتيجه حساسيت کمتري به محيط خود دارند.فرآيندهايي که در آنها از آنزيم هاي نامحلول معلق در محيط هاي آلي آبگريز استفاده ميشود براي بهينه سازي پراکندگي آنزيم به منظور بهبود دسترسي به سوبسترا و همچنين جلوگيري از تجمع ذرات هيدروفيل پروتئين ، نيازمند تثبيت هستند. علاوه بر اين ، تثبيت ، امکان بازيافت را تضمين ميکند. تثبيت آنزيم بر روي يک جامد نامحلول بايد ساده و مقرون به
