بخشی از مقاله
بررسی تأثیر سمیت گیاه Artemisia absinthium L. رویش یافته در دو ارتفاع مختلف، بر رده سلول سرطان سینه انسانی MCF7
چکیده
سابقه و هدف: با توجه به مقاومت سلولهاي سرطانی به داروهاي شیمیایی و گزارشات گوناگون از تأثیر گیاه Artemisia در درمان بیمايهاي مختلف، به منظور تعیین تأثیر محل رویش گیاه (ارتفاع زیاد و ارتفاع کم) بر سمیت اندامهاي مختلف، این پژوهش انجام شد. در این تحقیق اثر سمیت عصاره متانولی گل، برگ، ساقه و ریشه A.absinthium جمع آوري شده از دو ارتفاع مختلف، بر رده سلول سرطان سینه انسانی MCF-7 و سلول نرمال HEK293 مورد ارزیابی قرار گرفت.
روش بررسی: این تحقیق به روش تجربی در شرایط in vitro صورت گرفت. رده سلول سرطان سینه MCF-7 و سلول نرمال HEK293 به ترتیب در محیط کشت RPMI-1640 و DMEM حاوي %10 سرم جنین گاوي کشت داده شدند. نمونههاي خشک شده گیاهان توسط حلال متانولی عصارهگیري شدند و اثر سمیت سلولی هر چهار اندام بر سلولهاي سرطانی و نرمال در غلظتهاي 31/25، 62/5، 125، 250 و 500 میکروگرم بر میلی لیتر به روش MTT مورد ارزیابی قرار گرفت.
یافتهها: سمیت سلولی عصاره متانولی اندامهاي مختلف A.absinthium ارتفاع بالا نسبت به ارتفاع کم، %20 تا %30 بیشتر بود. عصارههاي حاصل از گل و ریشه A.absinthium ارتفاع بالا به ترتیب با 221 IC50 و بیشتر از 500 میکروگرم بر میلی لیتر، بیشترین و کمترین اثر سمیت را بر سلول سرطان سینه رده MCF7 نشاندادند. سمیت سلولی A.absinthium بر سلول نرمال %20 HEK293 تا %30 کمتر از سلول سرطانی بدست آمد.
نتیجهگیري: به نظر میرسد گیاه A.absinthium رویش یافته در ارتفاع بالا، تأثیر بیشتري بر سمیت سلولی دارد.
واژگان کلیدي: افسنتین، تستMTT ،MCF7 ، .HEK293
مقدمه
سرطان سینه یکی از شایع ترین نوع سرطانها در بین بانوان است، بر اساس گزارشات آماري در سالهاي اخیر در حدود %24/41 سرطانها در بانوان ایرانی از نوع سرطان سینه بوده است .(1) جراحی و درمانهاي مکمل مانند درمان دارویی، هورمونی، شیمی درمانی و رادیوتراپی از روشهاي درمان سرطان سینه میباشند .(2) یکی از بزرگترین محدودیتهاي داروهاي ضدسرطان، مقاومت سلولهاي سرطانی نسبت به دارو است که میتواند ناشی از مقاومت ذاتی تومور نسبت به دارو باشد یا در طول شیمی درمانی کسب شود و به گونهاي عمل میکند که سلولهاي مقاوم از بین سلولهاي هتروژن انتخاب میشوند، در نتیجه با افزایش سلولهاي مقاوم روند درمان مشکلتر میشود .(2) امروزه داروهاي گیاهی به علت عدم عوارض جانبی نسبت به داروهاي شیمیایی مورد توجه قرار گرفتهاند .(3) بالغ بر 3500 سال است که از گیاهان در درمان سرطان استفاده میشود(.(4 آلکالوئیدهاي کاتارانتوس رزئوس و وینکا آلبا یکی از بهترین ترکیبات گیاهی مورد استفاده در شیمی درمانی سرطان هستند .(2) داروهاي مهمی ازجمله وینکریستین، وینبلاستین، ویندزین، پودوفیلوتوکسین، -10هیدروکسی-کامپتوتسین، تاکسول و فیلانتوزید براي درمان سرطان کشف شدهاند .(3) Artemisia با نام فارسی درمنه از جمله گیاهان دارویی و متعلق به خانواده بزرگ Asteraceae است، بیش از 34 گونه از این جنس در ایران گزارش شده است، گونههاي متنوع آن از پستترین نقاط ایران از حاشیه دریاي خزر تا ارتفاعات 4000 متري رویش دارند Artemisia absinthium .(5) از جمله گونههاي مهم این جنس است که با عنوان افسنتین و wormwood شناخته میشود .(6) افسنتین گیاهی پایا از منطقه ایرانی-تورانی و خزري میباشد که در اروپا، ترکیه، ایران، آسیاي مرکزي، سیبري و افغانستان پراکندگی دارد .(5) A.absinthium در طب سنتی براي تسکین دردهاي مزمن، یرقان، نقرس، برونشیت، مالاریا، سیاه سرفه، زخمهاي لثه و دهان، سوزش معده و قلب، درد عصبی، التهاب، سرخک، تب و راش مورده استفاده قرار میگرفته است .(7-9) امروزه نیز در درمان رماتیسم، رفلکسمري، دردهاي قلبی، دیابت ملیتوس (10-12)، مالاریا 13)و(14، هپاتیت (15)، عفونتهاي قارچی (10)، باکتریایی (16)، ویروسی (از جمله هرپس سیمپلکس) (17) لیشمانیوز (18-20) و تنگی نفس (21) کاربرد دارد.
مطالعات فیتوشیمیایی حضور فلاونوئیدها، استروئیدها، ترپنوئیدها، ساپونینها، تاننها و روغنهاي فرار را در گونههاي مختلف درمنه و از جمله افسنتین نشان میدهند 5) و .(22
مطالعات زیادي بر روي اثرات ضد سرطانی عصارههاي الکلی و آبی این گیاه بر سلولهاي سرطانی و نرمال صورت گرفته است .(10) آرتمیزینین (23)کامفر، پاراسیمن و لینالول از ترکیبات موجود در A.absinthium میباشند .(24) در این تحقیق اثر سیتوتوکسیک عصاره متانولی گیاه A.absinthium جمعآوري شده از دو ارتفاع مختلف بر رده سلول سرطان سینه انسانی MCF7 و سلول نرمال HEK293 به صورت تجربی در شرایط in vitro مورد بررسی قرار گرفت. آزمایشات در شهریور ماه 1390 در آزمایشگاه کشت سلولی گروه بیوتکنولوژي دانشکده علوم وفناوريهاي نوین دانشگاه اصفهان انجام شد.
مواد و روشها
تهیه عصاره گیاهی
گیاه A.absinthium در شهریور ماه 1390 از شهر سیلوانا واقع در 40 کیلومتري غرب ارومیه از دو ارتفاع 1700 و2700 متري از سطح دریا جمعآوري و پس از شستشو، در سایه خشک گردیدند (گیاهان چند ساله مورد برداشت قرار گرفتند)سپس براي شناسایی به باغ گیاه شناسی تهران منتقل شدند.
قسمتهاي مختلف گیاه از جمله، گل، برگ، ساقه و ریشه به صورت جداگانه آسیاب و پودر شدند. 50 گرم ازپودر اندامهاي مختلف گیاه به صورت جداگانه با حلال متانولی به مدت 72 ساعت بر روي شیکر با دور 180rpm و دماي 25˚C قرار گرفتند، عصارههاي بدست آمده توسط دستگاه روتاري (Stero glass, Italy) در شرایط خلاء و در دماي 40˚C تغلیظ و در نهایت به وسیله دستگاه لیوفیلیز (Zirbus, Germany) خشک شدند. عصارههاي حاصل در کمترین مقدار دي متیل سولفوکساید (DMSO) حل شدند و با رقیق کردن آنها در محیط کشت غلظتهاي 31/25، 62/5، 125، 250 و 500 میکروگرم بر میلی لیتر تهیه شد .(10)
کشت و نگهداري سلولها
رده سلول سرطانی MCF-7 و سلول نرمال HEK293 از بانک سلولی انسیتو پاستور ایران تهیه و به ترتیب در محیط کشت
(Gibco) RPMI-1640 و DMEM حاوي %10 سرم جنین گاوي (FCS)، محلول پنیسیلین -(100U/ml) استرپتومایسین (100 μg/ml) و – L 2 mMگلوتامین کشت داده شدند. سپس در انکوباتور (N-Biotek) %5 Co2 نگهداري و هر 3 روز یکبار محیط کشت آنها تعویض گردید .(10)
بررسی سمیت سلولی با استفاده از روش MTT
بررسی اثر سیتوتوکسیتی عصارهها با روش رنگ سنجی، با استفاده از 3- (4, 5-dimethylthiazol-2yl)-2 , 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) انجام شد .(25) این روش بر اساس فعالیت آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلولهاي زنده استوار است، که محلول زرد رنگ MTT را به کریستالهاي بنفش رنگ فورمازان تبدیل میکند، که پس از حل کردن در DMSO میتوان آنها را در دستگاه الایزا ریدر مورد سنجش قرار داد .(26) مقدار180 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی در هر چاهک از پلیت 96 چاهکی، به گونهاي که هر میلی لیتر از محیط کشت داراي3×104 سلول باشد ریخته شد، سپس مقدار 20 µl از غلظتهاي مختلف عصارهها به چاهکهاي مورد نظر از پلیت اضافه گردید، به گونهاي که حجم نهایی هر چاهک به200 µl رسید.
دوکسوروبیسین به عنوان کنترل مثبت (کنترل مثبت براي مشخص شدن حساسیت یا عدم حساسیت سلولها به ماده سمیت سلولی مورد استفاده قرار میگیرد) و محیط کشت حاوي 0/5 درصد DMSO بدون هیج گونه عصارهاي به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شدند (کنترل منفی به منظور بررسی اثر حلال عصارهها یعنی DMSO بر سلولها استفاده میشود). پلیت به مدت 48 ساعت درون انکوباتور %5 Co2 و دماي 37˚C انکوبه گردید. سپس 20 میکرولتر محول MTT (5mg/ml) به هر چاهک از پلیت اضافه شد و به مدت 2 ساعت درون انکوباتور قرار گرفت، مقدار DMSO 100µl به منظور حل کردن کریستالهاي فورمازان جایگزین محلول قبلی شد و جذب در طول موج 560 nm توسط دستگاه الایزاریدر((Awareness خوانده شد. براي هر غلظت عصاره 3 تکرار تعیین گردید. درصد بقاء سلولی در گروه کنترل منفی 100 در نظر گرفته شد و از فرمول زیر بدست آمد. غلظتی از ترکیبات مورد آزمایش که درصد حیات سلولی را به نصف کاهش میدهد به عنوان IC50 لحاظ شد.
آنالیز آماري با استفاده از نرم افزار SPSS با آنالیز واریانس یک طرفه بررسی قرار گرفت. سطح معنی دار بودن اختلافات لحاظ شد و آزمون Post Hoc تست LSD استفاده گردید.
یافتهها
اثر سمیت سلولی عصاره متانولی 4 اندام (گل، برگ، ساقه و ریشه) گیاه A.absinthium جمعآوري شده از هر دو ارتفاع در 5 غلظت 31/25، 62/5، 125، 250 و 500 میکروگرم بر میلی لیتر بر سلول سرطانی و نرمال مورد بررسی قرار گرفت (نمودارهاي 1 تا (4 و جدول(.(1 نتایج حاصل نشان داد سلولها به کنترل مثبت حساس بوده و کنترل منفی نیز در غلظت مورد استفاده 0/5) درصد) هیچ گونه سمیت سلولی ندارد.
اثر سیتوتوکسیتی عصاره متانولی قسمتهاي مختلف گیاه، بر رده سلول سرطانیMCF-7 سیتوتوکسیتی Artemisia absinthium L. بر MCF7
اثر سمیت سلولی عصاره متانولی 4 اندام گیاه A.absinthium جمعآوري شده از هر دو ارتفاع بر سلول سرطانی مورد بررسی قرار گرفت (نمودار 1و(2 و IC50 آنها محاسبه گردید
نتایج حاصل از اثر عصاره ها بر سلول MCF7 نشان داد، با افزایش غلظت عصارهها درصد بقاء سلولی کاهش مییابد به طوري که کمترین بقاء سلولی در غلظت 500 µg/ml مشاهده شد. بیشترین سمیت سلولی در A.absinthium هر دو ارتفاع به ترتیب در گل، برگ، ساقه و ریشه مشاهده شد. سمیت سلولی A.absinthium ارتفاع بالا براي همه قسمتهاي گیاه بیشتر از A.absinthium ارتفاع پایین بدستآمد. IC50 عصارههاي A.absinthium ارتفاع بالا در گل، برگ، ساقه و ریشه به ترتیب 221 µg/ml، 343، 430 و>500 و در نمونه ارتفاع پایین در گل 352 µg/ml و در برگ، ساقه و ریشه >500 µg/ml محاسبه گردید.
اثر سیتوتوکسیتی عصاره متانولی قسمتهاي مختلف گیاه، بر رده سلول نرمال HEK293
نتایج حاصل از اثر سایتوتوکسیک عصارهها بر سلول نرمال HEK293 مشخص نمود، میزان سمیت عصارهها 20 تا 30 درصد کمتر از سلولهاي سرطانی میباشد (جدول.(1 بیشترین سمیت سلولی در A.absinthium هر دو ارتفاع به ترتیب در ریشه، ساقه، گل و برگ مشاهده گردید
(نمودار3و.(4 نتایج نشان داد، برخلاف مرحله قبل ریشه داراي سمیت بیشتري بر روي سلول نرمال میباشد. اثر سیتوتوکسیتی در A.absinthium ارتفاع بالا بیشتر از A.absinthium ارتفاع پایین بدست آمد. IC50 گیاه ارتفاع بالا براي ریشه، ساقه، گل و برگ به ترتیب 222 µg/ml، 228، 330، 499 و براي گیاه ارتفاع پایین در هر چهار اندام µg/ml > 500 محاسبه شد.
بحث
نتایج حاصل نشان میدهد عصاره متانولی قسمتهاي مختلف A.absinthium داراي خاصیت سایتوتوکسیک بر سلول MCF7 میباشند. نتایج مشابهی در ارتباط باخاصیت ضدسرطانی عصاره A.absinthum و Artemisia afra بر هر سه رده سلولی (Human breast adenocarcinoma) MCF-7، HT-29 (human colonic adenocarcinoma) و Hela گزارش شده است .(10) طبق مطالعات منتشر شده در دهه اخیر ترپنوئیدها و فلاونوئیدهاي موجود در Artemisia annua داراي سمیت بر
