بخشی از مقاله
چکیده
هدف این پژوهش بررسی تاثیر چند عامل بر القاي ریشه مویین در گیاه Artemisia annua L. - درمنه خزري - میباشد. از هر 3 نژاد Ar318، 15834 و A7 آگروباکتریوم رایزوژنز دو سوسپانسیون 1 - و - 2 تهیه و براي آلودگی قطعات برگ - ریزنمونه - 1 و دمبرگ گیاه - ریزنمونه - 2 استفاده گردید. پس از ظهور ریشهها، ماهیت تراریختگی آنها با تکثیر ژن rolB و به وسیله واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - تایید شد. نتایج نشان داد که عواملی مانند منبع و نحوه تهیه ریزنمونه، نژاد، ترکیب و pH محیط کشت آگروباکتریوم در زمان آلودگی بر القاي ریشه مویین در این گیاه موثر میباشد.
کلمات کلیدي: Artemisia annua L.، آگروباکتریوم رایزوژنز، سوسپانسیون باکتري، تهیه ریزنمونه، القاي ریشه مویین.
.1 مقدمه
درمنه خزري1 گیاهی یکساله از خانواده کاسنی میباشد. عصاره رقیق شده این گیاه در غلظتهاي کم، فعالیت باکتريهایی مانند اشرشیا کولی، استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سرئوس را مهار میکند، همچنین از این گیاه نوعی کومارین به نام اسکوپولتین2 جدا شده است که فعالیت ضد التهابی نشان میدهد. عصاره و روغنهاي ضروري گیاه به دلیل داشتن خاصیت ضد انگلی و آنتی اکسیدانی در صنعت دامپروري کاربرد دارد. در طب سنتی چین، این گیاه براي درمان تب و مالاریا استفاده میشود. مطالعات صورت گرفته در سال 1971 نشان داد که این خاصیت به دلیل وجود ترکیب آرتمیزینین3 در عصاره این گیاه میباشد . - 9 -
آرتمیزینین یک متابولیت ثانویه گیاهی میباشد که امروزه به طورگسترده اي علیه انگل مالاریا4 به کار میرود. به دنبال مقاومت این انگل به داروهاي موجود مانند کینینها در دهه 1960، دانشمندان چینی مطالعات گسترده اي را براي یافتن داروهاي جدید آغاز نموده و بسیاري از گیاهان مورد استفاده در تب سنتی چین مانند درمنه خزري را مورد بررسی قرار دادند. مطالعات آنها نشان داد که عصاره مشتق شده از این گیاه در موشها، خاصیت ضد مالاریاي قوي دارد. در سال 1971 اولین بار ترکیب ضد مالاریاي آرتمیزینین از عصاره این گیاه جداسازي شد و در سال 2005 سازمان بهداشت جهانی ترکیب دارویی بر پایه آرتمیزینین 1 - ACT - را براي درمان مالاریا معرفی نمود . - 6 -
قابل ذکر است که بیماري مالاریا مشکل عمده بسیاري از کشورهاي در حال توسعه مانند آفریقا و جنوب آسیا است. سالانه 300 تا 500 میلیون نفر در سراسر جهان به این بیماري مبتلا شده و نتیجه آن مرگ 1 تا 2 میلیون نفر در سال می-باشد. بنابر گزارش سازمان بهداشت جهانی سالانه 400 تا 600 میلیون دوز از ترکیبات دارویی بر پایه آرتمیزینین مورد نیاز است، در حالیکه فقط کمتر از 100 میلیون دوز آن در دسترس میباشد . - 11 - در ایران ابتلا به مالاریا در سالهاي اخیر روند نزولی داشته، با این حال نمونههایی از مقاومت این انگل نسبت به داروي کلروکولین - مهمترین داروي ضد مالاریا در ایران - گزارش شده است . - 1 -
آرتمیزینین تنها در برگها و بخش هاي هوایی گیاه درمنه خزري تولید شده و مقدار آن بسیار کم 0/01-0/5 - درصد وزن خشک - بوده، همچنین سنتز شیمیایی آن پیچیده و از نظر اقتصادي به صرفه نمیباشد . - 5 - یکی از راهکارهاي مهم به منظور بهبود تولید این ترکیب دارویی ارزشمند، کشت ریشههاي مویین گیاه درمنه خزري میباشد. در این پژوهش تاثیر منبع و نحوه تهیه ریزنمونه، نژاد، ترکیب و pH محیط کشت آگروباکتریوم رایزوژنز2 در زمان آلودگی بر القاي ریشه مویین در درمنه خزري بررسی شد.
.2 مواد و روش ها
.1.2 استریل کردن و کشت بذر درمنه خزري
بذر گیاه از مرکز تحقیقات جنگل و مرتع شهرستان نوشهر - استان مازندران - تهیه گردید. بذرها در اتانول 70 درصد - V/V - به مدت یک دقیقه و سپس محلول هیپوکلریت سدیم 5 درصد - V/V - به مدت 20 دقیقه غوطه ور گردید و در نهایت با آب مقطر استریل 3 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه شستشو داده شد. بذرها پس از استریل شدن، در زیر هود لامینار - مدل JTLR720، ساخت شرکت ژال تجهیز - در محیط موراشی-اسکوگ - MS - نیمه جامد - داراي 3 درصد ساکارز، 7 گرم بر لیتر آگار و pH برابر با - 5/7 کشت داده شد 50 - بذر در هر پلیت - و به اتاق رشد با دماي 25 ±2 درجه سانتیگراد و دوره نوري 16: 8 ساعت روشنایی به تاریکی منتقل گردید . - 2 -
.2.2 القاي ریشه مویین در گیاه درمنه خزري
سه نژاد 15834، A7 و Ar318 آگروباکتریوم رایزوژنز - تهیه شده از مرکز تحقیقات زیست فناوري کرج - براي القاي ریشه استفاده شد. هر نژاد باکتري در دو لوله آزمایش حاوي 10 میلیلیتر محیط لوریا برتانی مایع - LB - - داراي 50 میلیگرم در لیتر آنتیبیوتیک ریفامپین - کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دماي 25 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از 24 ساعت، جذب واکشتها در طول موج 600 نانومتر اندازهگیري شد - میزان جذب باید بین 0/5 تا 1 باشد - . از هر دو لوله آزمایش حاوي یک نژاد باکتري، یک لوله انتخاب و به عنوان سوسپانسیون - s1 - 1 براي آلوده کردن ریزنمونهها استفاده گردید و لوله دوم، براي تهیه سوسپانسیون - s2 - 2، به مدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و پس از دور ریختن محلول رویی، 10 میلیلیتر محیط تازه MS به رسوب حاصل اضافه گردید. بنابراین آگروباکتریوم در سوسپانسیون 1، در محیط LB و در سوسپانسیون 2 در محیط MS قرار دارد.
دو گروه ریزنمونه تهیه شد. در گروه اول برگهاي گیاه از دو انتها به قطعاتی با ابعاد 3 میلیمتر برش یافت - ریزنمونه - 1 و در گروه دوم دمبرگها از محل گره قطع شد - ریزنمونه . - 2 از هر گروه ریزنمونه، 6 عدد تهیه گردید. سطح ریزنمونه هاي 1 و انتهاي دمبرگ - نزدیک محل گره - در ریزنمونههاي 2 با استفاده از سرنگ انسولین حاوي سوسپانسیون 1 هر 3 نژاد آگروباکتریوم زخم زنی شد و این مراحل براي سوسپانسیون 2 آگروباکتریوم نیز تکرار گردید.
پس از آلودگی، هر دو گروه از ریزنمونهها در محیط MS نیمه جامد کشت شده و به اتاق رشدي با دماي 25±2 درجه سانتیگراد و نسبت 16:8 روشنایی و تاریکی انتقال یافتند. 48 ساعت پس از آلودگی، ریزنمونهها به محیط MS نیمه جامد حاوي 500 میلیگرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند، تا باکتريهاي باقی مانده در محیط حذف گردد.
واکشتهاي بعدي ریزنمونه ها هر دو هفته یکبار و با غلظت 250 میلیگرم در لیتر سفوتاکسیم صورت گرفت . - 14 - پس از ظهور ریشه ها، حدود 2 تا 3 سانتیمتر از نوك آنها بریده شد و به محیط B5 مایع - داراي 15 درصد ساکارز و pH برابر با - 5/7 حاوي 250 میلیگرم در لیتر سفوتاکسیم منتقل گردید. واکشت ریشه ها در این محیط هر دو هفته یکبار صورت گرفت.
.3.2 آنالیز مولکولی ریشه ها از طریق واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR -
با توجه به اینکه وجود باکتري در کشت ریشه ها بر نتایج به دست آمده در مرحله تایید مولکولی موثر است، باکتري باید کاملا از محیط حذف گردد. به منظور بررسی حذف آگروباکتریوم از کشت ریشهها، مطابق روش کومار و همکارانش - 2006 - ، مقداري از ریشهها بریده شد و به محیط LB مایع منتقل گردید. محیط حاوي ریشه در شیکري با دماي 25 درجه قرار گرفت. پس از 72 ساعت رشد باکتري در این محیط بررسی شد . - 10 -
ابتدا نژادهاي آگروباکتریوم از نظر توانایی انتقال ژن و تراریختگی ریزنمونهها مورد بررسی قرار گرفتند. براي این منظور پلاسمید باکتريها به روش لیز قلیایی استخراج گردید و واکنش PCR با استفاده از پرایمرهاي ژن rolB انجام شد. لازم به ذکر است که این ژن در ناحیه بیماريزاي T-DNA پلاسمید قرار دارد و وجود آن در باکتري نشان دهنده حضور پلاسمید القا کننده ریشه در سویههاي مورد استفاده میباشد.
براي تایید انتقال قطعه T-DNA پلاسمید آگروباکتریوم به ژنوم ریزنمونهها و القاي ریشه مویین، حضور ژن rolB در ژنوم ریشههاي القا شده با استفاده از واکنش PCR بررسی شد. براي این منظور DNA ریشهها استخراج گردید - 4 - و پلاسمیدهاي استخراج شده آگروباکتریوم نیز به عنوان کنترل مثبت مورد استفاده قرار گرفت. توالی پرایمرهاي اختصاصی طراحی شده براي ژن rolB در این پژوهش شامل 5'-ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCACGA-3' و 5'-TTAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTGCAGC-3' میباشد. شرایط دمایی براي PCR شامل 94 درجه سانتیگراد به مدت 10 قیقه براي واسرشت سازي اولیه، سپس 94 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه براي واسرشت
