بخشی از مقاله
چکیده
هدف از انجام این پژوهش بررسی اثر اضافه کردن مایع فولیکولی انسان به منی گاوهای نر سیمنتال دومنظوره - فلکفیه - بر تحرک اسپرم در طی مرحله انجماد بود. مایع فولیکولی انسانی از خانم های سالم بارور و تحت درمان لقاح آزمایشگاهی که مشکل ناباروری از مردان آنها بود استحصال، سانتریفیوژ و خنثی سازی شد. نمونه گیری اسپرم از مولدین نر مرکز اصلاح نژادی و تولید اسپرم گاو سیمنتال ایران انجام شد. انزال اول هرگاو به دو قسمت فاقد و حاوی مایع فولیکولی تقسیم شد. مایع فولیکولی طوری به منی اضافه شد تا در نهایت غلظت منی به 750 میلیون اسپرم در هر میلی لیتر برسد. اسپرم ها به روش تک مرحله ای منجمد شدند. کیفیت تحرک اسپرم ها با استفاده از نرم افزار CASA در منی تازه، متعادل و منجمد یخگشایی شده در گروه های حاوی و فاقد مایع فولیکولی بررسی شد. اضافه کردن مایع فولیکولی انسان به منی گاوهای نر تأثیری بر تحرک اسپرم های تازه و متعادل نداشت اما تحرک اسپرم هایی که مایع فولیکولی دریافت کرده بودند پس از یخگشایی بیشتر از گروه اسپرم های فاقد مایع فولیکولی بود. نتایج حاصل از یافته های این پژوهش نشان می دهد که مایع فولیکولی انسان می تواند سبب افزایش تحرک اسپرم گاوهای نر پس از انجماد شود که می تواند یافته قابل توجهی برای پژوهشگران صنعت تولید اسپرم منجمد و بیولوژی تولیدمثل باشد و پیشنهاد می شود تحقیقات دقیق تری برای شناسایی عامل و یا عوامل موجود در مایع فولیکولی که سبب بهبود انجمادپذیری اسپرم ها می شود انجام گردد.
کلمات کلیدی: مایع فولیکولی، تحرک اسپرم، سیمنتال دومنظوره شیری - گوشتی - فلک فیه -
مقدمه
انجماد موفق اسپرم پستانداران برای اولین بار توسط پولگ و همکاران در اوایل سال 1949 بر پایه مشاهده این امر غیر مترقبه که اسپرم ها بعد از انجماد و یخ گشایی در حضور گلیسرول %4 قادر به زنده ماندن هستند و درحالیکه که در غیاب آن می میرند، گزارش شده است . - 1 - از آن زمان به بعد مطالعات متعددی در ارتباط با انجماد اسپرم انجام گرفت و فرزندانی از تمامی حیوانات اهلی با استفاده از تلقیح اسپرم های منجمد یخ گشایی شده به دست آمد. آسیب شدیدی به غشا و آکروزوم اسپرم در طول مرحله انجماد وارد می شود که به علت تغییر دما، القاء استرس اسمتیک و تشکیل کریستال های یخ می باشد . - 2 - تحرک اسپرم برای جا به جایی اسپرم به مکان لقاح مهم است که وابسته به تولید انرژی توسط میتوکندری و همچنین گلیکولیز برای عملکرد نرمال اسپرم است . - 3 - اسپرم به شکل خود به خودی تولید انواع گوناگون گونه های فعال اکسیژن - ROS - را می کند که شامل آنیون سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و نیتریک اکساید می باشد . - 4 - میزان کم از ROS برای شروع چرخه فسفریلاسیون تیروزین مورد نیاز است که سبب ظرفیت پذیریٌ اسپرم می گردد. با این حال، با افزایش میزان تولید ROS توسط اسپرم، استرس اکسیداتیو القاء می گردد که می تواند باعث اختلال در ظرفیت باروری و تولید جنین نرمال گردد . - 4 - تولید ROS در اسپرم می تواند یکی از علل های کاهش باروری در اسپرم های تازه و یا قرار گرفته در پروسه های مختلف تکنیک های تولید مثل باشد . - 5 - مایع فولیکولی ماده ایست که در فضای خارج سلولی فولیکول ها جمع می شود. این مایع بیشتر از پروتئین های خون منشاء می گیرد که از طریق عروق لایه تکا وارد می شود. ترشحات اووسیت، سلول های گرانولوزا و تکا نیز در تشکیل مایع فولیکولی موثر است . - 6 - مایع فولیکولی انسان یک مایع بیولوژیکی است که به راحتی می تواند بدون در خطر انداختن کیفیت اووسیت ها بعد از جمع آوری اووسیت به روش IVF - لقاح اووسیت در شرایط آزمایشگاهی - ٍ، به میزان فراوان به دست آید . - 6 - ترکیبات شیمیایی مایع فولیکولی حیوانات اهلی مختلف و انسان به خوبی مستند شده است 7 - و . - 8 بیشتر پروتئین های پلاسما - از قبیل آلبومین - در مایع فولیکولی حضور دارند . - 9 - نشان داده شده است آلبومین جریان - خروج - کلسترول غشایی را برای ظرفیت پذیری در اسپرم رت - 10 - ، موش - 11 - ، و انسان - 12 - واسطه گری می کند. در طول انکوباسیون در شرایط آزمایشگاه، HDLَ لیپوپروتئین غالب پیدا شده در مایع فولیکولی انسان - 13 - ، خوک - 14 - و گاو - 15 - است. مطالعات متعددی نشان داده اند که HDL یک گیرنده کلسترول است و ممکن است به عنوان محتویات غشای سلول باشد . - 16 - استرول اصلیِ غشایسلولِ بیشتر پستانداران کلسترول می باشد - 17 - و 80 تا 90 درصد کل کلسترول سلول در غشاء پلاسما واقع شده است . - 18 - به واسطه تقابل با پروتئین ها و فسفولیپیدها کلسترول غشایی طیف گسترده ای از اثرات بر مشخصات فیزیکی غشاها از قبیل نفوذ پذیری و تغییر فاز دارد. کلسترول به فشردگی و سفتی غشاء پلاسمایی در درجه حرارت فاز انتقالی کمک می کند . - 19 - بنابراین کاهش در نسبت کلسترول به فسفولیپید در ارتباط با افزایش سیالیت و نفوذ پذیری غشاء سلولی است . - 20 - مشخص شده است که کلسترول بین غشای سلولی و لیپوپروتئین های سرم و بین غشای سلولی و پراکندگی های فسفولیپید مبادله می شود . - 21 - با تغییر نسبت کلسترول به فسفولیپید - افزایش میزان فسفولیپید - ، ساختار و عملکرد غشایی میتواند در زمان کاهش درجه حرارت متأثر شود . - 22 - به صورت طبیعی در طی ظرفیت پذیری اسپرم، کلسترول از طریق مولکول های گیرندهٌ موجود در محیط خارج سلولی اسپرم مانند آلبومین و HDL برداشته می شود که هر دو در داخل مایع فولیکولی مشاهده شده اند . - 23 - به همین دلیل حدس زده می شود که بتوان با اضافه نمودن مایع فولیکولی به مایع منی و یا رقیق کننده جهت انجماد منی قبل از انجماد باعث کاهش میزان آسیب غشای سلول اسپرماتوزوئید در طی فرآیند انجماد شد. این پژوهش به بررسی این موضوع که آیا اضافه کردن مایع فولیکولی انسان به رقیق کننده اسپرم گاوهای دومنظوره شیری - گوشتی سیمنتال - فلکفیه - می تواند سبب بهببود تحرک آنها پس از انجماد گردد یا خیر، می پردازد.
روش کار
مایع فولیکولی انسانی - HFF - ٍ از خانم های تحت درمان IVF بدست آمد که دارای میانگین اووسیت بالا بوده و مشکل ناباروری از مردان آنها بوده است. گونادوتروپین مونوفاز انسانی برای تحریک تخمدان ها بعد از تجویز بوسرلین مورد استفاده قرار گرفت. نمونه مایع فولیکولی انسانی فاقد خون، از بزرگترین فولیکول ها به دست آمد و سپس در دور 300 g به مدت 10 دقیقه برای برداشتن باقیمانده های سلولی سانتریفیوژ شد. با قرار دادن نمونه ها در بن ماری در دمای 56 œC به مدت نیم ساعت بر علیه سیستم کمپلمان غیر فعال سازی صورت گرفت. سپس نمونه ها مدت 24 ساعت در یخچال قرار گرفته و پس از آن با استفاده از فیلتر های سرسرنگی ʽm 0/44 فیلتر شده و در نهایت در دمای -20 œC ذخیره سازی شدند . - 24 -
نمونه های منی از مولدین نر سیمنتال دومنظوره در مرکز اصلاح نژادی و تولید اسپرم گاو سیمنتال با استفاده از مهبل مصنوعی بدست آمد. در هر مرحله اسپرم گیری تنها انزال اول از هر مولد جهت بررسی در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفت. در این مرحله منی به دو قسمت تقسیم شد. الف - منی فاقد مایع فولیکولی ب - منی حاوی مایع فولیکولی انسانی. لازم به ذکر است در این تحقیق برای اولین بار و با یک روش ابداعی نوین مایع فولیکولی به اسپرم اضافه شد. در مطالعات گذشته محققین هنگامی که قصد بررسی تأثیر مایع فولیکولی بر کیفیت اسپرم را داشتند، مایع فولیکولی را به نسبت حجم مایع انزالی - از %10 تا - %75 به اسپرم اضافه می کردند 25 - و - 26 و این در حالی بود که این امر یا پس از شستشوی منی و جدا شدن پلاسمای منی از اسپرماتوزوئیدها انجام می گرفت و مایع فولیکولی به اسپرم فاقد پلاسمای منی اضافه می شد و یا اینکه مایع فولیکولی به مایع منی شسته نشده - بدون در نظر گرفتن تعداد اسپرماتوزوئیدها در هر انزال - 27 - و - 28 اضافه می گردید. اما از آنجائیکه در این تحقیق قصد بر شستشوی اسپرم گاو نبوده و نباید باشد - چراکه اسپرم ها در
