بخشی از مقاله
چکیده
در این مطالعه به منظور بررسی تولید پلیفنل رزوراترول تحت تأثیر الیسیتورها، آزمایشی در گیاه انگور رقم سلطانی در شرایط درون شیشهای انجام شد. هورمون اسیدسالیسیلیک به عنوان الیسیتور در غلظتهای 10-6، 10-5، 10-4 مولار به محیط کشت MS بدون هورمون جهت بررسی تنش اضافه گردید. مشاهده شد که تیمار اسیدسالسیلیک درمجموع باعث افزایش تولید رزوراترول در گیاه انگور شده و بین تیمار حاوی 10-4 مولار اسید سالسیلیک و سایر تیمارها اختلاف معنیداری وجود دارد. و میزان ماده رزوراترول در تیمار شاهد 3/94 میکروگرم بر میلی لیتر و در تیمار حاوی 10-5 مولار اسید سالسیلیک 3/25 میکروگرم بر میلی لیتر بود که اختلاف معنی داری باهم نداشتند، اما در تیمار حاوی 10-4 مولار اسید سالسیلیک به میزان 6/10 میکروگرم برمیلی لیتر رسید که نشان از افزایش ماده رزوراترول در گیاه انگور است. در بررسی کلی، نتایج نشان دادند که تیمار اسیدسالیسیلیک میتواند بهعنوان محرک تولیدی رزوراترول عمل کرده و باعث ارتقای خاصیت دارویی گیاه انگور در کشت درون شیشهای شود.
مقدمه
ترکیبات فنلی شامل گروه متنوعی با بیش از 4000 ترکیب گیاهی طبیعی هستند که در انگور شامل فلاوان- 3 -اولها، آنتوسیانینها، هیدروکسی سیناماتها، فلاونولها و استیلبنها است . - Adams, 2006 - یکی از متداولترین استیلبنها رزوراترول - C14H12O3 - است که فواید بسیاری در سلامتی انسان دارد - Bradamante et al., 2004 - فیتوالکسین رزوراترول متابولیت ثانویه مرتبط با سیستم دفاعی گیاه است که به هنگام آلودگی با پاتوژنها یا به سبب سایر محرکهای خارجی افزایش مییابد . به این دلیل ، توجه ویژهای به روشهای موثر برای تولید رزوراترول وجود دارد .
سنتز متابولیت ثانویه مثل رزوراترول در انگور میتواند توسط مولکولهای سیگنال تنظیم شود . - Zhao et al., 2005 - اسیدسالییسلیک - - SA، یک مولکول سیگنال مهم در پاسخ به تنش در گیاهان - Liu et al., 2005 - ترکیب فنلی است که در سرتاسر سلسله گیاهی توسط مسیر فنیل پروپانوئید سنتز میشود . - Metraux, 2002 - در گیاهان، SA در مقاومت سیستمیک - SAR - و مقاومت موضعی - LAR - در پاسخ به حملههای پاتوژنی مختلف مشارکت دارد - Vlot et SA .al., 2009 - به عنوان یک سیگنال تنظیم کننده پاسخ گیاه و مقاومت به یک رنج وسیعی از تنشهای غیر زنده مثل UV یا ازن، خشکی، شوری، سرما، گرما و فلزات سنگین شناسایی شده است . - Yuan and Lin, 2008 - در تحقیقی با اعمال 50 میکرومول اسید سالسیلیک روی انگور Vitis aramus، مشاهده شد که میزان رزوراترول نسبت به نمونهی شاهد افزایش قابل ملاحظهای داشته است
این تحقیق با هدف مطالعه و ارزیابی اثر اسیدسالیسیلیک بهعنوان الیسیتور در افزایش تولید ماده رزوراترول در برگ انگور رقم سلطانی - بیدانه سفید - انجام گرفته است.
مواد و روشها
این پژوهش در آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهان باغی و کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز انجام گردید. گیاهچههای انگور رقم سلطانی در شرایط درون شیشهای که عاری از آلودگی بودند از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه گردیدند. با توجه به محدود بودن تعداد شاخسارهها، ابتدا تکثیر شاخسارهها و پرآوری نمونهها انجام شد. بدین منظور، شاخسارههای دارای 3 گره به محیط کشت پرآوری انگور انتقال داده شده و درنهایت از گیاهچه های اولیه، تعداد 20 شیشه گیاهچه حاوی تعداد 3 ریز نمونه در هر شیشه بدست آمد. در این پژوهش، از محیط کشت MS برای تکثیر و پرآوری و همچنین اعمال تیمار سالیسیلیک اسید استفاده شد.
تیمار سالیسیلیک اسید ابتدا استوک سالیسیلیک اسید با غلظت 10-2 مولار آماده گردید. به منظور اعمال غلظت های مختلف از سالیسیلیک اسید، از چهار ارلن 250 میلی لیتری حاوی مقادیر صفر - شاهد - ، 10-4 ، 10-5 و 10-6 مولار از SA استفاده گردید که از طریق محیط کشت MS بدون هورمون به حجم رسانیده شدند.
اندازه گیری محتوی رزوراترول برگ انگور محتوی رزوراترول برگ در سه تکرار از هر تیمار و با استفاده از کارماتوگرافی مایع- فازمعکوس انجام شد. در این راستا، 0/5 گرم نمونه برگی از هر تکرار مربوط به هر تیمار برداشت شد و پس از پودر نمودن در ازت مایع، 5 میلیلیتر متانول آبی 80 درصد که دو درصد آن Hcl بود، به هر نمونه اضافه گردید. نمونه ها به مدت 20 دقیقه و با دور 4000 سانتریفیوژ شده و سپس فاز بالایی مایع از فیلتر سرنگی 0/45 میکرومتری عبور داده شدند.
برای تهیه استاندارد رزوراترول، ابتدا 0/2 میلیگرم از استاندارد وزن شده و درون 10 میلیلیتر متانول خالص ریخته شد. سپس برای تهیه غلظت رقیقتر، 0/4 میلیلیتر از محلول آماده را برداشته و دوباره با متانول خالص به حجم 10 میلیلیتر رسانیده شد و برای تهیه غلظت بعدی از محلول دوم ساختهشده به روش قبل، 0/4 میلیلیتر برداشته شد و دوباره با متانول به حجم رسانیده و درنهایت 3 غلظت از استاندارد رزوراترول ساخته شدند. شناسایی رزوراترول با یک سیستم HPLC با ستون Agilent zorbax C 18- SB - طول 15 سانتیمتر و 3/5 میکرومتر قطر - و دمای ستون 25 درجه سانتیگراد انجام شد. فاز متحرک شامل دو محلول A - آب به همراه 0/1 درصد اسید فرمیک - و B - استونیتریل به همراه 0/1 درصد اسید فرمیک - بود که بهصورت گرادیانت، سرعت جریان0/3 میلیلیتر در دقیقه و جریان تزریق پنچ میکرو لیتر بود
جدول -1 مشخصات برنامهای دستگاه HPLC جهت بررسی میزان ماده رزوراترول
با توجه به دادههای حاصل از نمونههای استاندارد معادله خط مطابق فرمول - 1 - به دست آمد که با جایگذاری دادههای به دست آمده برای هر تیمار در معادله خط، غلظت رزوراترول موجود در هر تیمار به دست آمد. سپس مقدار متوسط ماده رزوراترول برای هر نمونه محاسبه گردید.
آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با جهار تکرار انجام گردید.در این بررسی هر یک از تیمارها در چهار شیشه - تکرار - اعمال شدند و هر شیشه محتوی چهار ریزنمونه انگور بود. از نرم افزار آماری SPSS برای تجزیه و تحلیل دادهها استفاده گردید.
نتایج و بحث
یافتههای پژوهش حاضر نشان میدهد که بین تیمارهای مختلف اسیدسالیسیلیک از نظر تاثیر در محتوای رزوراترول اختلاف معنی دار آماری وجود دارد. و اسید سالیسیلیک دارای اثر القایی مثبت در انگور بوده و میتواند تولید متابولیت ثانویه رزوراترول را متاثر سازد. در این تحقیق میزان ماده رزوراترول در تیمار شاهد 3/94 میکروگرم بر میلی لیتر و در تیمار حاوی 10-5 مولار اسیدسالسیلیک، 3/25 میکروگرم بر میلیلیتر بود که اختلاف معنیداری با هم نداشتند، اما در تیمار حاوی 10-4 مولار اسیدسالسیلیک به میزان 6/10 میکروگرم برمیلیلیتر رسید که نشان از افزایش ماده رزوراترول در گیاه انگور میباشد.
نتایج مقایسه میانگین - شکل - 1 نشان میدهد که در تیمارهای اسیدسالیسیلیک با افزایش غلظت اسیدسالیسیلیک، محتوی رزوراترول نیز افزایش پیدا میکند. که این نتایج با مطالعات قبلی در این زمینه هماهنگ است. Voung و همکاران - 2014 - در تحقیقی برای کشت سوسپانسیون سلولی انگور از الیسیتورهای مختلف از جمله اسیدسالیسیلیک استفاده کردند و نتایج نشان داد که رزوراترول درون سلولی چندین برابر افزایش یافت. در حالت کلی میتوان نتیجه گرفت که تولید متابولیتهای ثانویه در کشت بافت گیاهی میتواند توسط الیسیتورها افزایش یابد . - Collin and Edwards , 1998 - و اسیدسالیسیلیک هم به عنوان یک الیسیتور سبب افزایش بیان ژن استیلبن سنتاز و به تبع آن افزایش رزوراترول در انگور میشود
