بخشی از مقاله
چکیده
آزادیراختین یکی از موثرترین حشره کش هاي گیاهی جهان است. دراین پژوهش تاثیر میزان نیتروژن محیط کشت بر تولید آزادیراختین در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه چریش مورد بررسی قرار گرفت. آزمایش به صورت طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. کالوس هاي حاصل از ریزنمونه برگ در محیط سوسپانسیون سلولی در معرض 3 غلظت مختلف KNO3 1/9 - ، 3/8، 5/7 گرم در لیتر - قرار گرفتند. پس از6هفته، کالوس ها جمع آوري، خشک و آزادیراختین آن ها با متانول عصاره گیري شد. آنالیز کمی میزان آزادیراختین تولید شده با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا 1 - HPLC - انجام شد. نتایج نشان داد که میزان آزادیراختین تولیدي در محیط سوسپانسیون حاوي 1.9 گرم در لیتر KNO3 به طور معنی داري بیشتر از سایر تیمارها می باشد. به نظر می رسد که در سوسپانسیون سلولی گیاه چریش تولید آزادیراختین تحت تاثیر غلظت KNO3 قرار می گیرد.
کلمات کلیدي: آزادیراختین، چریش، سوسپانسیون سلولی،KNO3، .HPLC
مقدمه
امروزه به دلیل مشکلات متعدد ناشی از آفت کش ها برمبناي مواد موثره مصنوعی، تلاش براین است تا آفت کش هاي بیولوژیک و طبیعی جایگزین آنها گردد. آزادیراختین - C35H44O16 - تترانورتریترپنوئیدي است، که اولین بار در سال 1968 توسط مورگان و باتر ورث2 از بذر درخت چریش Aazdirachta indica A.juss استحصال شد . - 1 - این درخت در نواحی گرم جنوب ایران به وفور رشد می کند. آزادیراختین معروف ترین و موثرترین حشره کش گیاهی است، که ازنظر مولکولی بسیار قطبی، غیر فرار و داراي 9 ایزومر A تا H است. این ترکیب از 3 حلقه کربوکسیلیک و 5 حلقه هتروسیکلیک تشکیل شده است. اندام هاي مختلف چریش داراي تنوع زیادي در تولید آزادیراختین می باشند آن را می توان با حلال هاي آلی مانند متانول، اتانول، اتیل استات و دي کلرومتان از برگ و مغز دانه چریش استخراج کرد . - 6 - به دلیل تاثیر شرایط محیطی و ژنتیکی بر میزان تولید این ماده در حالت طبیعی وهمچنین مشکل بودن سنتزشیمیایی آن، کشت کالوس و سوسپانسیون سلولی این گیاه براي تولید آزادیراختین بسیار مورد توجه بوده است - . - 2 از روش هاي مختلف کروماتوگرافی مانند HPLC, TLC, GC براي آنالیز کمی و کیفی این ماده استفاده شده است. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا براي تجزیه و شناسایی طیف وسیعی از ترکیبات آلی و معدنی با نقطه جوش بالا و پایین، ترکیبات بسیار قطبی، غیر فرار و نمونه هاي بیولوژیکی استفاده شده استبه. سبب وجود دو فاز رقابتی معمولاً پیک ها به صورت متقارن ایجاد می شوند.به دلیل قطبیت این ترکیب روش GC براي آنالیز آن مناسب نمی باشد . - 6 - در این پژوهش تولید آزادیراختین در سوسپانسیون سلولی گیاه چریش و شناسایی و آنالیز ترکیب آن به کمک روش HPLC، مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها
مواد گیاهی و کشت سوسپانسیون سلولی
نمونه هاي برگ از درختان چریش منطقه بندرعباس جمع آوري و استریل شد. کالوس هاي حاصل از کشت ریز نمونه برگ بروي محیط کشت جامد موراشیک و اسکوگ - - MS حاوي 6 میلی گرم در لیتر IBA، 2 میلی گرم در لیترBAP و0.7 درصد آگار به محیط کشت سوسپانسیون سلولی مشابه به محیط کشت قبلی همراه با سه غلظت 1/9 - ، 3/8، 5/7 گرم در لیتر - KNO3 منتقل شدند. کشت سوسپانسیون سلولی به مدت 6 هفته بر روي شیکر با دور 100rpm، در شرایط تاریکی و درجه حرارت 25±2°C انجام شد.
اندازه گیري وزن خشک
براي محاسبه وزن خشک سلولی سوسپانسیون ها با دور3000 rpm به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردیدند. سپس کالوس هاي رسوب کرده را در دماي28 ±2°C قرار داده تا به وزن ثابت برسند - . - 3
استخراج و آنالیز آزادیراختین
جهت اندازه گیري میزان آزادیراختین، ابتدا کالوس خشک به کمک هاون پودر شد. سپس مقدار20 mg پودرحاصله را با 1 میلی لیتر متانول به وسیله دستگاه هموژنایزر مخلوط کرده و به مدت 5 دقیقه با دور13000 rpmسانتریفیوژ گردید. محلول لایه فوقانی آن جدا شده و 20 میکرولیتر از آن به دستگاه HPLC تزریق گردید - . - 5 فاز حامل مورد استفاده شامل استونیتریل و آب به نسبت 63:37 بود میزان جریان حلال برابر با 1 میلی لیتر در دقیقه تنظیم گردید. ارزیابی آماري با استفاده از آزمون هاي آنالیز واریانس ANOVA و با استفاده از نرم افزار SPSS انجام گرفت.
تهیه استاندارد
به ماده استاندارد آزادیراختین - Sigma A 7430 - که داراي 0/05 میلی گرم ازاین ماده موثره بود، 0/5 میلی لیتر متانول اضافه شد سپس به طور دستی خوب تکان داده شد تا کاملاً حل شود.با افزودن این مقدار متانول محلول استاندارد با غلظت 100 PPm بدست آمد، از این محلول استاندارد غلظت هاي 5 - ، 10، 20، 30 و - 50PPm از طریق رقیق سازي با فاز حامل تهیه گردید.
نتایج وبحث
تولید متابولیت ثانویه گیاهی در شرایط آزمایشگاهی، فواید زیادي در مقایسه با استخراج این ترکیبات از گیاهان، تحت شرایط طبیعی دارد. تغییر در ترکیب مواد مغذي محیط کشت تولید مانند کربوهیدرات، نتیروژن و فسفر، اثرات قابل توجهی بر سنتز متابولیت هاي ثانویه ایجاد می نماید نتایج نشان داد که سلول هاي سوسپانسیون حاوي 3/8 گرم در لیتر KNO3 بیشترین وزن خشک را در مقایسه با غلظت هاي دیگر KNO3 داشتند. میزان آزادیراختین تولیدي در محیط سوسپانسیون حاوي 1.9 گرم در لیتر KNO3 به طور معنی داري بیشتر از سایر تیمارها می باشد - جدول . - 1 در کشت سوسپانسیونی کالوس هاي حاصل از ساقه چریش افزایش غلظت نیترات اثر قابل توجهی بر تولید آزادیراختین داشت - راوال و همکاران . - 2003 به نظر می رسد که در سوسپانسیون سلولی گیاه چریش تولید آزادیراختین تحت تاثیر غلظت KNO3 قرار می گیرد.
جدول .1 تاثیر غلظت هاي مختلفKNO3 بر وزن خشک سلولی و میزان آزادیراختین
شکل.1 کروماتوگرام جداسازي در - a - .HPLC کروماتوگرام جداسازي نمونه استاندارد آرادیراختین. - b - کروماتوگرام جداسازي تیمار حاويg/l . KNO31.9
