بخشی از مقاله
ذخیره سازی طولانی سوسپانسیون سلولی چند رقم برنج (.Oryza sativa L) ایرانی به عنوان ژرم پلاسم در مافوق سرما
خلاصه
نگهداری مواد ژنتیکی در مافوق سرما تکنیکی است که در بسیاری از مراکز تحقیقاتی دنیا برای نگهداری ژرم پلاسم گیاهی در مدت زمان طولانی از آن استفاده می نمایند. جهت استفاده این تکنیک در نگهداری ژرم پلاسم برنج، آزمایشی انجام شده تا دریافته شود سوسپانسیون سلولی را حداکثر چه مدت می توان با حفظ باززایی آن در مافوق سرما نگهداری نمود؟ برای این منظور ابتدا در محیط کشت LS.2.5 از بذور سه رقم برنج ایرانی (آمل -۳، خزر و طارم) كالوس تولید شد. سپس در محیط کشت های مایع AA2 و R2 سوسپانسیون سلولی برای ارقام مختلف تشکیل شد. جهت ذخیره کردن سوسپانسیون سلولی در ازت مایع، سلول ها را در محیط کشت های مایع AA و R به مدت ۳ الی ۴ روز واکشت نموده سپس 0.2 گرم از این سلولها به داخل ظروف کوچک از جنس پولی پروپیلن انتقال داده و همزمان 0.750 سانتی متر مکعب از مخلوط مواد ا 3g pH 5 . 8 همراه با پروئین 5 گرم در لیتر اضافه نموده تا سوسپانسیون سلولی بتواند سرمای زیاد را تحمل نماید. بعد از این عمل ظروف حامل سلول ها را به مدت یک ساعت در داخل یخ نگهداری نموده و سپس آنها را در داخل ظروف آلومینیومی گذاشته تا به داخل ازت مایع انتقال داده شود. جهت انتقال به داخل تانک ازت مایع ابتدا به مدت ۳۰ دقیقه در دمای منهای : ۳۰ نگهداری و بعد از آن در مافوق سرما ( ۱۹6-) به مدت دوازده ماه نگهداری گردید. بعد از یک سال ظروف از ازت مایع بیرون آورده شد و بلافاصله در داخل آب گرم سترون " 45 برای مدت یک تا دو دقیقه نگهداری شد. بعد از اینکه سلول ها از یخ زدگی به حالت اولیه برگشت مواد اضافه شده با پیپت جدا شده و سلولها بر روی محیط کشت نیمه جامد R و ;AA که روی آن دو فیلتر از نوع واتمن گذاشته شده بود، کشته گردید و در دمای ۱+- ۲۹ و در تاریکی نگهداری شد. نتیجه این مطالعه نشان داد که بعد از دوازده ماه نگهداری سلولها در مافوق سرما مجددا برای همه رقمها سوسپانسیون سلولی تشکیل شد. سوسپانسیون سلولی تشکیل شده برای تولید پروتوپلاست استفاده گردید. ارقام آمل -۳ و طارم در مقایسه با شاهد تقریبا دو برابر افزایش تولید پروتوپلاست داشته ولی رقم خزر در مقایسه با شاهد ۲۰% افزایش داشته است. همچنین در مقایسه باززایی پروتوپلاستها با پروتوپلاست های شاهد نتایج نشان داد که ارقام آمل ۳ و خزر به طور معنی داری کاهش باززایی داشته اما برای رقم طارم در مقایسه با شاهد اختلاف معنی داری مشاهده نشده است. در این آزمایش به ترتیب برای ارقام آمل -۳ خزر و طارم تعداد ۲۶، ۳۲ و 4۹ گیاه سبز به دست آمده است.
واژه های کلیدی: سوسپانسیون سلولی، برنج، پروتوپلاست، باززایی، مافوق سرما، ژرم پلاسم، ذخیره سازی طولانی
مقدمه برای حفظ و نگهداری مواد ژنتیکی در مدت زمان طولانی، تکنیک ذخیره سازی در مافوق سرما یکی از روشهایی است که در حال حاضر در دسترس محققین میباشد. در این درجه سرما کلیه فعالیتهای متابولیسمی و تقسیمات سلولی متوقف می شود. از نظر تئوری سلولها و بافت ها را میتوان در چنین شرایطی برای مدت زمان نامحدود نگهداری نمود (۱۰). سلول ها را می توان به ظروف بسیار کوچک انتقال و سپس آنها را بدون هر گونه آلودگی در محیطی که هزینه نگهداری آنها بسیار پایین است حفظ نمود (۳۰).
یکی از مشکلاتی که در ارتباط با سوسپانسیون سلولی مطرح است این است که آنها قدرت باززایی خود را در مدت زمان اندک، از دست می دهند (۱۹ و ۲۶). از طرفی نگهداری سوسپانسیون سلولی در درازمدت مستلزم صرف هزینه زیاد و زمان می باشد (۲).
مراحل مختلف ذخیره سازی مواد ژنتیکی در مافوق سرما عبارتند از: رشد قبل از انجماد، اضافه کردن مواد حفظ کننده از سرما، سرد کردن، ذخیره سازی در ماقوق سرما و بازیافت أن از مافوق سرما (۶). این مراحل از گونه ای به گونه دیگر گیاهی متفاوت است (۱۹). برای رشد قبل از انجماد مواد ژنتیکی و آماده کردن آنها برای تحمل آسیب شدید مافوق سرما، از موادی نظیر ساکارزه سوربیتول، مانیتول، دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا پلی اتیلن گلیکول استفاده میشود. این مواد با کاهش میزان آب سلولی درصد زنده ماندن سلول ها را بعد از ذخیره سازی در مافوق سرما افزایش می دهند. به خصوص در سلول هایی که دارای واکوئولهای بزرگ هستند، مواد فوق تأثیر قابل ملاحظه ای در افزایش درصد زنده مانی این نوع سلولها خواهند گذاشت (۶ و ۲۹). مانیتول با کاهش حجم سلول سبب افزایش میزان زنده مانی سلولها بعد از تحمل مافوق سرما میشود (۳۱ و ۳۲). ایزومر مانیتول یعنی سوربیتول برای نگهداری سوسپانسیون سلولی کلم، سویا و داتوره در مافوق سرما استفاده شده است (۲۸). پلی اتیلن گلیکول برای نگهداری کلم در مافوق سرما استفاده شده است تا سلولها حالت شیشه ای به خود بگیرند و از آسیب سرما جلوگیری شود و یا آسیب یخ زدگی سلولی به حداقل برسد (۱۶). اضافه نمودن موادی نظیر DMSO یا گلیسرول به بافتهای گیاهی تقریبا یک ساعت قبل از انجماد، از نفوذ آب به داخل سلول جلوگیری می کند و در نتیجه نقطه یخ زدگی داخل سلول پایین می آید و بدین ترتیب نه تنها آسیب انجماد کاهش می یابد بلکه از آسیب بازیافت از انجماد هم جلوگیری می شود. از طرف دیگر نیز شکل گیری کریستال یخ چه در زمان منجمد کردن و چه در زمان برگشت از انجماد هم جلوگیری می کند و بدین ترتیب میزان اسیب به غشا و ارگانلهای سلولی به حداقل خود می رسد (۲۷). اگر سلول های منجمد شده خیلی آهسته از حالت انجماد بازیافت شوند. بلحاظ شکل گیری کریستال یخ باعث آسیب به آنها می گردد لذا جهت به حداقل رساندن آسیب ذکر شده باید سلول ها را به سرعت در داخل حمام آب گرم حاوی آب ولرم سترون با c°۴۵ حرارت قرار داد تا از شکل گیری کریستال های یخ جلوگیری شود (۱۹).
عملیات بازگشت سلول ها از حالت انجماد باید در تاریکی صورت پذیرد تا از آسیب اکسیداسیون نوری جلوگیری گردد. این موضوع اولین بار توسط بنسون و همکاران در سال ۱۹۸۹ برای نگهداری مریستم های سیب زمینی به عنوان ژرم پلاسم در مافوق سرما گزارش شده است (۲۷). همه مواد جلوگیری کننده از آسيب سرما که قبل از انجماد به محیط کشت سلول اضافه می شود در درازمدت سمی هستند و بایستی به نوعی از دسترس سلولها و بافتهای گیاهی خارج گردند. جهت جدا کردن مواد مورد نظر، سلول ها پس از بازیافت از انجماد، روی فیلتر کاغذی دو لایه که بر روی محیط کشت نیمه جامد قرار می گیرد، کشت میشوند (۱۰ و ۱۸). بهترین نشانه زنده بودن سلول ها پس از بازیافت از انجماد، ادامه رشد این سلولها روی محیط کشت است اما تکنیک های دیگری نظیر استفاده از روش رنگ آمیزی حیاتی با فلوروسنت یا آزمون تری فنیل تترازولیوم کلریده (TTC) برای دریافت سریع وضعیت زنده بودن سلول ها هم استفاده می شود (۲۵).
گزارش های متعددی مبنی بر باززایی گیاه پس از دریافت از سوسپانسیون سلولی ذخیره شده در مافوق سرما وجود دارد. لینچ و همکاران پس از ۸ ماه نگهداری سوسپانسیون سلولی برنج از نوع ژاپونیکا در مافوق سرما گزارش نموده اند که باززایی آنها به اندازه باززایی سوسپانسیون سلولی شاهد بوده است. همچنین باززایی از سلول های ذخیره شده در مافوق سرما برای گیاهانی نظیر گندم (۱۵)، کلم (۸)، مارچوبه (۲۳)، جو (۱۲)، الوليوم جاپونيکم (۲۰) و شبدر (۳۴) نیز گزارش شده است.
با توجه به اهمیت سوسپانسیون به عنوان منبع تولید پروتوپلاست در غلات، هدف این مطالعه ارزیابی نگهداری سوسپانسیون سلولی برنجهای ایرانی به عنوان ژرم پلاسم در مافوق سرما بوده است.
مواد و روشها بذور ارقام برنج طارم، خزر و آمل -۳ پس از دریافت از موسسه تحقیقاتی برنج آمل، جهت مشخص کردن تیپ آنها به موسسه تحقیقات بین المللی برنج (IRRI) واقع در فیلیپین ارسال شد. پس از مطالعه با ایزوزایم مشخص شد طارم و خزر از نوع ژاپونیکا و أمل - ۳ از تیپ ایندیکا است بذور ارقام فوق پس از جدا کردن گلوم و گلومل، ضد عفونی شده و با قرار دادن روی محیط کشت LS (۱۷) حاوی 2.5 میلی گرم در لیتر D-2 , 4 بعد از ۴ هفته كالوس بدست آمد. جهت تولید کالوس های رویاتزا مجددا روی همان محیط کشت وأكشت گردید. جهت تشکیل سوسپانسیون سلولی، به میزان یک گرم از کالوس های فوق در ارلن مایر ۲۵ سانتی متر مکعبی که حاوی ۱۰ سانتی متر مکعب از محیط کشت های مایع AA2 (۲۲) و R2 (۲۴) بوده، انتقال یافته و سپس روی شیکر با ۱۲۰ دور در دقیقه در دمای : ۱+۲۵ در تاریکی نگهداری شد. سوسپانسیون سلولی ارقام أمل - ۳ و خزر در محیط کشت AA و سوسپانسیون سلولی رقم طارم در محیط کشت ,R بدست آمد. در ماه اول هفته ای دو بار واکشت انجام میشد، بدین ترتیب که محیط کشت قدیم با همان حجم محیط کشت جدید جایگزین میشد. سپس محیط کشت همراه با کالوس به
ارلن مایر ۵۰ سانتی متر مکعبی انتقال یافته و هفته ای یکبار با ۲۰ سانتی متر مکعب از محیط کشت جدید جایگزین می گردد، به این ترتیب بعد از ۳ تا ۶ ماه، سوسپانسیون سلولی برای ارانام فوق تشکیل شد. جهت آماده کردن سوسپانسیون سلولی بری تحمل شرایط مافوق سرما، یک سانتی متر مکعب از سوسپانسیون سلولی قبل از ذخیره نمودن در مافوق سرما، در ۲۶ سانتی متر مکعب محیط کشت های 2AA (برای ارقام آمل - ۳ و خزر) و 2R (برای طارم) که حاوی ۶۰ گرم در لیتر مانیتول بود، انتقال یافت. سه الی چهار روز بعد یک سانتی متر مکعب از سوسپانسیون سلولی را با پیپت برداشته و روی میکروغربل سترون با قطر سوراخهای mر ۴۵، انتقال داده تا محیط کشت از دسترس سلول ها خارج شود. سپس 0.2 گرم از سلول ها ر به داخل ظروف کوچک از نوع پولی پروپیلن انتقال داده و 0.75 سانتی متر مکعب از مخلوط مواد حفظ کننده از من ماء (همراه با پرولین ۵ گرم در لیتر) به آنها اضافه شد. هر یک از ظروف کوچک را تکان داده تا این مواد با سلولها مخلوط شود (۲۱). ظروف کوچک حاوی سلولها را داخل ظروف آلومینیومی گذاشته و سپس یک ساعت قبل از اینکه به انبار ذخیره نیتروژن انتقال داده شوند در داخل حمام آب یخ قرار داده شدند تا دمای آنها پایین بیاید. سلولها | با استفاده از روش ويترزو کینگ (۳۱) و با استفاده از یک دستگاه فریزری که مجهز به برنامه کامپیوتری بوده به داخل نیتروژن مایع انتقال داده شد. در این روش ابتدا به سلول ها اجازه داده می شود در هر دقیقه یک درجه سانتی گراد برودت آنها افزایش یاید، تا اینکه برودت این سلول ها ظرف مدت ۳۵ دقیقه به منهای ۳۵°c برسد و بعد از آن برای مدت طولانی در ازت مایع (c° ۱۹۶-) ذخیره می شود.
بعد از دوازده ماه نگهداری سوسپانسیون سلولی در مافوق سرما، سلولها از ازت مایع بیرون آورده شد و بلافاصله در حمام آب گرم که حاوی آب ولرم سترون ، ۴۵ بود به مدت یک تا دو دقیقه نگهداری شد. وقتی که سلول ها از حالت انجماد شارج شدند مواد نگهداری کننده از سرما با استفاده از میکروپیپت از دسترس سلول ها خارج شدند. سلولها روی فیلترهای کاغذی دو لایه از نوع واتمن که قطر آنها ۵/ ۵ سانتی متر بود و در داخل پتری دیشهای ۹ سانتی متری روی محیط کشت های AA2 برای ارقام طارم و آمل - 3) و R2 (برای رقم خزر) قرار داشت، کشت گردیدند. بدین ترتیب محتويات هر ظرف کوچک در داخل یک پتری دیش ۹ سانتی متری انتقال داده شد. پتری دیشها با نسکوفیلم بسته و در تاریکی در دمای c ۲۶ + ۱ نگهداری شدند. جهت اینکه مواد نگهداری کننده از سرما سریعتر از دسترس گیاه خارج شوند بعد از سه روز سلول ها روی محیط کشت جدید واکشت شدند. جهت جلوگیری از آسیب اکسیداسیون نوری کلیه عملیات بازیافت سلول ها از حالت انجماد، در تاریکی بانور بسیار کم انجام شد.
پنج روز بعد از کشت سلول ها، درصد زنده بودن سلولها از روش کاهش تری فنیل تترازولیوم کلرید (TTC) (۲۵) اندازه گیری شد. سه سانتی متر مکعب از TTC (0.6درصد وزنی به حجمی) در بافر (۵ درصد مول) و توئین ۸۰ (۵ درصد حجمی) با همراه با ۵۰ میلی گرم سلول ها به لوله های سانتریفیوژ ۱۶ سانتی متر مکعبی انتقال داده شد. سلول ها در تاریکی در ۲۸ برای ۱۲ تا ۱۸ ساعت نگهداری شدند. سپس ۱۰ سانتی متر مکعب أتانول ۹۵٪ به هر لوله سانتریفیوژ اضافه شد و به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه در حرارت c ۱۰۰ در حمام آب گرم در حال جوش نگهداری شدند تا نمک تترازولیوم از سلول ها استخراج شود. بعد از این مرحله لوله های سانتریفیوژ از حمام آب گرم بیرون آورده و به محتویات هر یک از آنها با اضافه نمودن الكل ۹۵ درصد به ۷ سانتی متر مکعب رسانده شد. میزان جذب نور با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج ۴۹۰ نانومتر قرائت شد. این عمل برای سلولهای شاهد (انجماد نشده) انجام شد و درصد زنده ماندن هر یک از نمونه ها در مقایسه با شاهد بیان شد. سوسپانسیون سلولی تشکیل شده برای تولید بازیافت از انجماد، با استفاده از روش بابائیان (۳) تشکیل شد، سوسپانسیون سلولی تشکیل شده برای تولید پروتوپلاست مورد استفاده قرار گرفت. پروتوپلاستها از سوسپانسیون های هر ۳ رقم و شاهد با استفاده از روش بابائیان و همکاران (۴) استخراج شد. میزان عملکرد، درصد زنده بودن پروتوپلاست ها و درصد استخراج خودبخودی آنها بر اساس روش بابائیان و همکاران (۴) اندازه گیری شد. پروتوپلاست ها به میزان ۲۶۱۰۶. با استفاده از روش آنتونی و همکاران (۱) روی محیط کشت KPR (۱۴) با استفاده از روش کشت پرستاره کشت گردیدند. درصد کالوس ها بعد از ۲۸ روز از کشت پروتوپلاست با استفاده از استریومیکروسکوپ محاسبه گردید. هنگامی که قطر کالوس ها به ۱ تا ۲ میلی لیتر رسید (۵ تا ۸ هفته) روی محیط کشت باززایی (MSKN که دارای ۲ میلی گرم در لیتر کینتین، 0.5 میلی گرم در لیتر NAA، ٪۳ وزنی به حجمی ( w / v ) ساکارز و با بود، انتقال داده شد. پتری دیشها با نسکوفیلم بسته و در دمای در تاریکی نگهداری شد. کالوس ها به تدریج بعد از دو هفته شروع به باززایی نمودند. برای تکثیر گیاهان تولیدی از محیط کشت ریزازدیادی"(MSBP) استفاده شده است. همچنین برای ایجاد ریشه از محیط کشت ریشه زاییه (MSN1 . 5 ) و تحت شرایط نور فلورسنت استفاده شده است. با استفاده از نرم افزار آماری SPSS میانگین و انحراف معیار محاسبه گردید و از روش آزمون t - استيودنت و روش دانکن مقایسه میانگینها انجام شد.
نتایج و بحث با توجه به جدول 1 مشاهده می شود که کالوس ها از بذور ارقام طارم، آمل -۳ و خزر تولید شد. کالوسهای تولید شده در ارقام مختلف با هم اختلاف معنی داری نداشته اند. درصد کالوس های رویانزا رقم طارم به طور معنی داری بیشتر از دو رقم دیگر بوده است. همچنین با توجه به جدول 1 مشاهده میشود که کالوس های رقم آمل -۳ به طور معنی داری در تولید ریشه با دیگر ارقام تفاوت داشته اند. کالوس رویانزای تمام ارقام مورد مطالعه برای تولید سوسپانسیون سلولی استفاده شده است. بعد از ۳ تا ۵ ماه سوسپانسیون سلولی برای هر سه رقم تشکیل شد. سوسپانسیون تمام ارقام جنین زا و دارای قدرت باززایی مطلوب بوده اند. سوسپانسیون سلولی هر سه رقم بعد از ۶ ماه از تشکیل، در مافوق سرما ذخیره شدند
بعد از ۱۲ ماه ذخیره سازی سوسپانسیون سلولی در مافوق سرما هر یک از ظروف کوچک با محتوی سوسپانسیون سلولی به طور مستقیم در داخل حمام آب گرم حاوی آب ولرم سترون ، ۴۵ انتقال داده شد. بعد از اینکه سلول ها از حالت یخ زدگی بیرون آمدند همراه با شاهد (بدون ذخیره سازی در مافوق سرما) روی فیلترهای کاغذی از نوع واتمن که به صورت دو لایه روی محیط کشت های AA و R2 گذاشته شده بودند کشت گردیدند. دو لایه کردن کاغذ فیلتر سبب می شود که مواد اضافه شده سریع از دسترس سلولها خارج شود و بدین ترتیب اسيب دیدن سلول ها به حداقل برسد (۱۸). این سلولها ۶ الی ۱۰ روز بعد از کشت از نظر رنگ و رشد به حالت اولیه برگشت نمودند. تجزیه آماری نشان داده است که سلول های بازیافت شده از مافوق سرما، در مقایسه با شاهد از رشد کمتری برخوردار بودند جدول ۲). رشد سلول ها روی محیط کشت بهترین گواه زنده ماندن سلول هاست، اما میزان زنده بودن سلول ها با استفاده از روش TTC برای هر سه رقم همچنانکه در جدول ۳ آمده است محاسبه گردید. این روش شامل اندازه گیری فعالیت آنزیم دهیدروژناز سلولها است تا TTC را احیا کند و به محصولات فورمازان قرمز تبدیل نماید که این مواد با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه گیری می شود. تجزیه آماری نشان داده است که اختلاف بسیار معنی داری بین قدرت زنده ماندن سلول های شاهد و سلول های ذخیره شده در مافوق سرما مشاهده شده است. همان طور که در جدول ۳ ملاحظه می شود، واریته خزر بالاترین قدرت زنده بودن سلولها و ارقام آمل ۰-۳ و طارم کمترین را در مقایسه با شاهد دارا بودهاند (جدول ۳).
از سلول های بازیافت شده در مافوق سرما سوسپانسیون سلولی تشکیل شد. سوسپانسیون سلولی تشکیل شده به عنوان یک منبع جهت تولید پروتوپلاست استفاده گردید.
سوسپانسیون های تمام ارقام در مقایسه با شاهد به دور معنی داری افزایش در تولید پروتوپلاست نشان دادند (جدول 1). البته پروتوپلاست های الحاق یافته خود بخودی که یک ارزش منفی در استخراج پروتوپلاست محسوب می شود در بین پروتوبلاستهای تولید شده از سوسپانسیون سلولی تشکیل شده از سلول های ذخیره شده در مافوق سرما بیشتر از شاهد برده است (جدول ۴). درصد زنده بودن پروتوپلاست هایی که از سوسپانسیون سلولی تشکیل شده از سلولهای ذخیره شده در مافوق سرما استخراج شده اند در مقایسه با درصد زنده بودن پروتوپلاست هایی که از سوسپانسیون سلولی شاهد استخراج شده اند تفاوت معنی دار نشان نداده اند (جدول ۵) میزان ۰ / ۲ سانتی متر مکعب محیط کشت KPR که حاوی ۲۰۱۰ پروتوپلاست بود با استفاده از روش کشت پرستار روی فیلترهای کاغذی از نوع واتمن که روی محیط کشت نیمه جامد KPR گذاشته شده بود، کشت گردیدند. بعد از ۲ تا ۳ هفته کالوس های رویان زا تولید شده که قطر آنها ۱ تا ۲ میلی لیتر بوده است. تجزیه آماری نشان داده است که در بین
