بخشی از مقاله
چکیده:
شیکونین رنگدانه اي است به رنگ قرمز ارغوانی که فعالیت زیستی بالا داشته و در ریشه برخی از اعضا خانواده گل گاو زبان - Boraginaceae - از جمله Onosma dasytrichum یافت می شود. این ماده خاصیت آنتی بیوتیکی و ضد قارچی و ضد التهابی داشته و در صنایع محصولات آرایشی و پارچه در مقیاس وسیع استفاده می شود. در تحقیق حاضر تشکیل کالوس و کشت سوسپانسیون سلولیOnosma dasytrichum با هدف بهینه کردن تولید شیکونین تحت تاثیر محیط کشت هاي مختلف بوده که در تحقیق حاضر یافتن بهترین نوع محیط کشت تحت بررسی می باشد. همچنین به طراحی سیستم هایی براي کشت سوسپانسیون سلولی Onosma dasytrichum براي تولید شیکونین در مقیاس وسیع پرداخته می شود.
کلمات کلیدي: Onosma dasytrichum، شیکونین، کالوس، کشت سوسپانسیون سلولی، متابولیت ثانویه
مقدمه:
گیاهان متابولیت هاي ثانویه متنوعی تولید می کنند از جمله آلکاکویید ها، فلاونویید ها، ترپنویید ها، آنتوسیانین ها و ... که فعالیت هاي بیولوژیکی گوناگونی داشته و ارزش تجاري فراوانی دارند. اما تولید این مواد در گیاهان در شرایط طبیعی به وسیله عوامل محیطی ، اکولوژیکی و آب و هوایی محدود می شود. - 7 - همچنین تولید متابولیت هاي ثانویه در بافت هاي اختصاصی بوده و به سن گیاه نیز بستگی دارد - . - 4 در سال هاي اخیر از تکنولوژي کشت بافت، ارگان و سلول گیاهی به طور موثري در تولید متابولیت هاي ثانویه استفاده شده است - . - 9,8,6 با مقایسه گیاهان رشد کرده در شرایط طبیعی و گیاهان رشد کرده در شرایط کشت درون شیشه اي متوجه می شویم که بافت ها و سلول هاي رشد کرده در شرایط درون شیشه اي میزان بیشتري از ترکیبات فعال از نظر بیولوژیکی را تولید می کنند.
به علاوه کشت سلول ها، ارگان ها و بافت ها به وسیله شرایط محیطی و اکولوژیکی محدود نمی شود و می توان به راحتی شرایط را کنترل کرد. - 7 - لازم به ذکر است سلول ها و بافت هاي رشد کرده در شرایط درون شیشه اي نسبت به گیاهان رشد کرده در شرایط طبیعی از نظر بیولوژیکی فعالیت بیشتري نشان می دهند - 7،4،. - 13 از میان روش هاي کشت درون شیشه اي کشت سوسپانیسون سلولی بهترین سیستم براي تولید متابولیت هاي ثانویه است چون نرخ رشد سریعتري را نشان می دهد - . - 7,1Onosma dasytrichum متعلق به خانواده Boraginaceae می باشد این گیاه دارویی ارزشمند، بومی ایران بوده و از مناطق کوهستانی شهرستان مهران جمع آوري شد.
شیکونین و ایزومرش آلکانین، قرمز رنگ بوده و متابولیت ثانویه ایست که در ریشه تولید می شود اخیرا محققین متوجه شدند که آلکانین ها فعالیت ضد التهابی، ضد میکروبی، ضد توموري داشته و همچنین داراي خاصیت درمان زخم ها بوده و قابلیت تولید رنگ در غذا و صنعت پارچه و لوازم آرایشی دارد - . - 5به علت افزایش جمعیت انسان و چهارپایان وضعیت گیاهان وحشی به ویژه گیاهان دارویی تحت تاثیر قرار گرفته است. کشت بافت گیاهی روشی کارآمد براي نگهداري و تکثیر سریع گیاهان دارویی مهم و تولید ترکیبات فعال زیستی می باشد - - 11 تحقیق حاضر این اهداف را دنبال می کند: - 1تشکیل کالوس و کشت سوسپانسیون سلولی - 2 بهینه سازي محیط کشت براي تولید بیشتر کالوس و رنگدانه شیکونین.
مواد و روش ها:
بذور گیاه Onosma dasytrichum از نواحی کوهستانی شهرستان مهران در اردیبهشت ماه و خرداد سال1389 جمع آوري و به پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوري منتقل شد. روش استریل این بذر ها بدین ترتیب بود: بذور با آب مقطر استریل و تریتون 3٪ به مدت 20 دقیقه تکان داده شد. بعد از شستشوي کامل با آب مقطر در بن ماري 55°C براي مدت 10 دقیقه گذاشته و بلافاصله روي یخ قرار داده شد. از این مرحله به بعد زیر هود انجام گرفت. شستشو با الکل 70٪ به مدت 2 دقیقه انجام و سپس 3 الی 4 مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شد. بذور به مدت 10 دقیقه در معرض پراکسید هیدروژن 10٪ قرار گرفته و به دنبال آن با آب مقطر استریل 3 الی 4 بار شستشو شدند. بعد از 15 دقیقه شستشو با هیپوکلریت سدیم 50٪ ، 8 الی 10 بار شستشو با آب مقطر استریل انجام شد.پوسته بذر ها با تیغ جراحی جدا سازي شد و بذر هاي بدون پوسته در محیط MS جامد بدون هورمون کشت شدند.
براي القاي تشکیل کالوس ، لپه هاي سبز شده با تیغ اسکالپل قطعه قطعه شد و در محیط MS جامد القاي کالوس - Kin 2.15 mg/Lو-2,4 D 1 mg/L - کشت شد. کالوس هاي تولید شده به محیط رشد کالوس - Kin 2.15 mg/L و - 2,4-D 0. 2 mg/L منتقل گردید.به منظور یافتن بهترین محیط رشد کالوس، کالوس ها در محیط هاي MS،LS ،MG_5 ،M9 ،White ،B5 کشت شدند. همچنین براي پی بردن به بهترین غلظت ساکارز تیمارهایی با محیط MS با میزان ساکارز 30 و 40 و 50 و gr/L 60 گذاشته شد.براي یافتن بهترین غلظت هورمونی تیمار هاي 2,4-D با 3 غلظت 1و0/5 و mg/L 0/2 و 2,4,5-T در 3 غلظت 1و0/5 و 0/2 mg/L در محیط پایه MS گذاشته شد. محیط MS بدون هورمون نیز براي پی بردن به میزان تاثیر هورمون در رشد کالوس، تیمار دیگر تحت بررسی بود. به منظور ارزیابی اثر محیط در محتواي تولید آلکانین، کالوس ها در محیط القاي رنگ کشت شد. سپس به محیط هاي رنگدهیM9و White منتقل شد.
نتایج و بحث:
بذور گیاهان Onosma dasytrichum به علت رشد در شرایط طبیعی آلودگی بسیار بالایی داشتند و تحت تیمار هاي شدید استریل کردن باز هم آلودگی نشان می دادند. آلودگی مشاهده شده در این بذر ها بیشتر از نوع باکتریایی بوده و به علت اینکه الکل آبگیر قوي است وباکتري به رطوبت براي زندگی نیاز دارد از الکل 70٪ با زمان بیشتري در سیکل استریلیزاسیون استفاده شد. پوسته بذر ها بسیار سخت بود و حتی با خراش دهی با اسید سولفوریک غلیظ و سمباده و تیغ جراحی باز هم جوانه زنی اتفاق نیفتاد، به همین علت در نهایت، پوسته به طور کامل جدا گردید. درصد جوانه زنی این بذر ها بسیار پایین بود و 87٪ بذر ها لپه و جنین ناقص داشتند. از لپه ها و بذر ها براي کالوس دهی استفاده شد که لپه ها کالوس هاي بیشتري تولید کردند.
لپه هاي رشد کرده قطعه قطعه شدند و در محیط القاي کالوس که شامل محیط MS جامد القاي کالوس - Kin 2.15 mg/L و - 2,4-D 1 mg/L بود گذاشته شد. پس از 2 هفته کالوس هاي شکل گرفته به محیط رشد کالوس - Kin 2.15 mg/L و 2,4-D - 0.2 mg/L منتقل شد. کالوس ها همگی فنوتیپ یکسان داشته و گرانولی و کرم رنگ بودند - شکل . - 12,4-D هورمونی است که تاثیر زیادي در تشکیل و رشد کالوس داشته به همین علت تیمارهایی براي یافتن بهترین غلظت این هورمون گذاشته شد که این هورمون ها تحت بررسی است.2,4,5-T همانند 2,4-D علف کش سیستمیک است که به عنوان هورمون اکسین در محیط هاي کشت استفاده می شود اما راندمان بالاتري در مقایسه با 2,4-D داشته، به همین منظور تیمار هاي این هورمون نیز در دست بررسی است - . - 10
براي تولید رنگدانه کالوس ها از محیط رشد به محیط القاي رنگ که MS تغییر یافته - حذف NH4 و 1/5NO3 برابر - حاوي هورمون هاي IAA 0.2 mg/L وKin 2.15 mg/L به مدت 2 هفته کشت شد. سپس به محیط هاي رنگدهی M9 و Whiteمنتقل گردید. کاهش و یا حذف NH4 باعث افزایش تولید متابولیت ثانویه در بسیاري از گیاهان میشود - . - 2 با حذف NH4 براي حفظ نسبت C/N در محیط رشد گیاه مقدار 1/5 NO3 برابر گردید.لازم به یادآوري است که هورمون 2,4-D مانع تولید رنگدانه شده به همین علت از هورمون IAA در محیط هاي رنگدهی استفاده می شود.
