بخشی از مقاله
چکیده
زوفا - Hyssup officinalis - ، یکی از گونههاي تیره نعناعیان - Lamiaceae - است که از روزگاران قدیم در مجموعه گیاهان دارویی مورد توجه خاص بوده است. به منظور بررسی تاثیر الیسیتور کیتوزان بر مقادیر فنول، فلاونوئید و ترکیبات آنتی اکسیدانی سوسپانسیون سلولی برگ گیاه زوفا، آزمایشی به صورت کاملاً تصادفی با سه تکرار در سال 1396 در پژوهشگاه زیست فناوري دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوري پیشرفته کرمان اجرا شد.
آزمایش کالوسزایی با استفاده از ریزنمونه - برگ - در محیط کشت پایه MS با غلظتهاي مختلف هورمون 0/5 ,0 - 2.4-D و 1 میلی گرم در لیتر - انجام شد. صفات مورد مطالعه در آزمایش اول شامل وزن تر و قطر کالوس و در آزمایش دوم هم شامل بررسی میزان فنل، فلاونوئید وآنتی اکسیدان، حاصل از کشت سوسپانسیون بود.
نتایج کالوسزایی نشان داد که بیشترین وزن تر و قطر کالوس مربوط به غلظت 1/5میلیگرم هورمون 2-4-D بود. همچنین نتایج حاصل از کشت سوسپانسیون نشان داد که در سوسپانسیون برگ بیشترین میزان فنول، فلاونوئید از محیط کشت و خواص آنتیاکسیدانی از محیط کشت MS حاوي 30 میلیگرم در لیتر کیتوزان به دست آمد.
مقدمه
زوفا - Hyssopus officinalis - متعلق به خانواده نعناعیان و بومی مناطق گرم و نیمه خشک است. این گیاه دارویی براي تقویت دستگاه گوارش، رفع ناراحتیهاي عصبی و افسردگی، استفاده میشود . - Kazazi et al., 2007 - اسانس زوفا خاصیت ضد باکتري و ضد قارچی داشته و در صنایع غذایی و آرایشی کاربرد دارد.
یکی از راههاي افزایش این مواد دارویی در شرایط کشت بافت استفاده از محركهاست. محركها ترکیباتی با منشاء زیستی یا غیرزیستی هستند که به طور مؤثر تولید متابولیتهاي ثانویه را در کشت سلولهاي گیاهی تحریک میکنند . کیتوزان، یک پلی ساکارید پلی کاتیونی، از ترکیب اصلی دیواره سلولی بسیاري از گونههاي قارچی میباشد که به عنوان الیسیتور زیستی کارآمد،
براي بهبود بخشیدن بیوسنتز متابولیتهاي ثانویه درکشت سلولی بسیاري از گیاهان دارویی تأیید شده است و در ریحان کیتوزان موجب افزایش مقدار کل ترکیبات فنولی و ترپن دار، به ویژه اسید رزمارینیک و اوژنول شد . - Kim et al., 2009 - با توجه به مطالب بیان شده هدف از این تحقیق بررسی اثر الیسیتوري کیتوزان بر افزایش ترکیبات فنولی و فلاونوئیدي سلولهاي سوسپانسیون برگ گیاه زوفا میباشد.
مواد و روش ها
این آزمایش در سال 1396، در آزمایشگاه گروه زیست فناوري دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوري پیشرفته کرمان بر پایه طرح کاملأ تصادفی در سه تکرار در مراحل زیر انجام شد. بذور گیاه زوفا - - Hyssup officinalis از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. بذور درون شیشه هاي حاوي محیط کشت MS که حاوي 30 گرم ساکارز، 8 گرم آگار و PH = 5/8 بودند، کشت شدند و به اتاقک رشد با دماي25 ± 2 فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل گردیدند.
از گیاهچه هاي حاصل براي تولید کالوس استفاه گردید. سپس قطعاتی از برگ به محیط کشت MS پایه حاوي سه سطح 0/5، 1 و1/5 از هورمون 2,4-D منتقل شدند، پس از القاي کالوس وزن تر و قطر کالوس، مورد اندازهگیري قرار گرفت براي تهیه کشت تعلیقی 2 گرم کالوس نرم سفید و همسن که پس از دو ماه 3 بار واکشت شده بود به 50 میلی لیتر محیط کشت MS بدون آگار اضافه شد و روي شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه در دماي 25 درجه سانتی گراد در شرایط تاریکی نگهداري شد
تیمار سلولها با کیتوزان
براي انجام این مرحله از تحقیق، ابتدا به منظور ایجاد یک کشت همگن و یکنواخت کشت سلولی تهیه شده در مرحله قبل 3 بار واکشت شد در هر مرحله سلول ها با استفاده از قیف و کاغذ صافی استریل جمع آوري و به محیط کشت جدید منتقل گردید و در روز پنجم سلولها به طور جداگانه با غلظت هاي 0، 10، 20 و 30 میلی گرم در لیتر کیتوزان تیمار شدند. سلول ها پس از گذشت 5 روز به منظور بررسی میزان فنل، فلاونوئید و آنتی اکسیدان مورد بررسی قرار گرفتند.
مقدار ترکیبات فنولی، فلاونوئیدي با روش Chang و همکاران - 2002 - سنجیده و جهت تعیین خواص آنتی اکسیدانی سلولها از روش - 2005 - Pandjaitan استفاده شد.آنالیز داده ها با استفاه از نرم افزار SAS نسخه9.1 انجام شد و مقایسه میانگین صفات با آزمون چند دامنهاي دانکن صورت گرفت.
نتایج و بحث
اندازه گیري وزن و قطر کالوس برگ نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادههاي جدول 1 نشان داد که وزن و قطر کالوسهاي برگ گیاه زوفا تحت تأثیر هورمون 2-4-D قرار گرفت و اختلاف از نظر آماري در سطح یک درصد معنیدار گردید.
جدول:1 نتایج تجزیه واریانس برخی صفات کالوس برگ زوفا تحت تأثیر 2,4-D
نتایج مقایسه میانیگین جدول 2 نشان داد با افزایش غلظت محلولپاشی بر مقدار وزن تر و قطر کالوس افزوده شد به طوري که بیشترین مقدار صفات مورد بررسی از تیمار 1/5 میلی گرم 2-4-D بدست آمد.
جدول :2 مقایسه میانگین اثر هورمون 2-4-D بر برخی صفات سلولهاي کالوس برگ زوفا
حروف مشابه در هر ستون نشاندهنده تفاوت غیرمعنیدار بین آنهاست
نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس دادهها نشان داد که مقدار فنول، فلاونوئید و خواص آنتی اکسیدانی سلول هاي سوسپانسیون برگ تحت تأثیر سطوح مختلف الییتور کیتوزان قرار گرفت و اختلاف از نظر آماري در سطح یک درصد معنی دار گردید - جدول - 2
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که با تیمار کیتوزان، میزان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدي به ترتیب نسبت به شاهد افزایش 24/97
شکل 1 اثر تیمار کیتوزان بر میزان فنول کل سلول هاي سوسپانسیون برگ شکل 2 اثر تیمار کیتوزان بر میزان فلاونوئید سلولهاي سوسپانسیون برگ همچنین نتایج مقایسه میانگین نشان داد که افزایش غلظت کیتوزان میزان خواص آنتیاکسیدانی نسبت به شاهد افزایش نشان داد به طوري که بیشترین مقدار مربوط به تیمار 30 میلی گرم در لیتر کیتوزان بود و کمترین مقدار هم مربوط به سطح شاهد بود
شکل-3اثر تیمار کیتوزان بر خواص آنتی اکسیدانی سلول هاي سوسپانسیون گیاهان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدي را در پاسخ به برخی ترکیبات پیامرسان که نقش دفاعی مهمی دارند، آزاد میکنند. ترکیبات فنولی به خصوص فلاونوئیدها و همچنین فلاونولها به دلیل خاصیت آنتیاکسیدانی قوي قادر به بدام انداختن رادیکالهاي آزاد و کاهش تنش اکسیداتیو هستند .
این ترکیبات با مکانیسمهاي متعددي مانند پاکروبی رادیکالهاي آزاد، دادن هیدروژن، کلات کردن یونهاي فلزي و یا همکاري با پراکسیدازها در جمع آوري یا حذف پراکسید هیدروژن، نقش آنتی اکسیدانی خود را ایفا میکند . - Kovacik et al., 2009 - نتایج این تحقیق نشان داد که با فزایش میزان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدي خواص آنتی اکسیدانی افزایش مییابد و با نتایج Ghasemzadeh و همکاران - 2012 - که بیان کردند که رابطه مثبتی بین محتواي فنول کل و فعالیت آنتیاکسیدانی آنها وجود دارد مطابقت دارد.
یکی از راه هاي افزایش متابولیتهاي ثانویه استفاده از الیسیتورهاي زنده و غیر زنده است محركهاي زیستی مانند کیتوزان به ترکیبات دیواره سلولی حمله میکنند و در پی پاسخ به پیام محرك، سیستم دفاعی گیاه فعال میشود. محركها به وسیله گیرنده گیاهی یا بعضی از پروتئین شناسایی میشوند. شناسایی در دیواره پلاسما، آغاز سیگنال پاسخدهی میباشد. بعد از سیگنال تحریک، گیرندههاي گیاهی سیگنال اجراییشان را مثل نشت یونی، انفجار اکسیداتیو را به کار میاندازد و به وسیله مولکولهاي پیامبر دوم مثل H2O2، اسید جاسمونیک، اسید سالسلیک، و تلفیق چند ژن و سرانجام بیان ژن دفاعی مانند فنیل آلانین آمونیالیاز - PAL
