بخشی از مقاله
تاثیر الیسیتور جاسمونیک اسید بر میزان تروپان آلکالوئیدهای هیوسیامین و هیوسین در ریشه های مویین گیاه Hyoscyamus niger
چکیده
دو تروپان آلکالوئید هیوسیامین و هیوسین از مواد مهم دارویی هستند که از گیاهان خانواده سولاناسه از جمله گیاه بنگدانه (Hyoscyamus niger) استخراج میشوند. این تروپان آلکالوئیدها به واسطه تاثیر بر روی سیستم عصبی پاراسمپاتیک در درمان تشنج، سیاه سرفه، سل و برونشیت مزمن مورد استفاده قرار میگیرند. بدلیل کاربرد وسیع این آلکالوئیدها در تهیه داروهای مهم از روشهای مختلفی برای افزایش این تروپان آلکالوئیدها استفاده میشود.
در این پژوهش، ابتدا بذرهای گیاه بنگ دانه تهیه و پس از جوانه زدن، برای ایجاد گیاهچه کامل در محیط کشت B5 حاوی 1 میکرومولار در لیتر IBA کشت شدند. از برگهای گیاهچه به عنوان ریزنمونه در القای ریشه مویین استفاده شد. قطعات برگی توسط سویه اگروباکتریوم رایزوژنز A4 آلوده شدند. در مرحله بعد، ریشه های مویین تحت تاثیر غلظتهای مختلف جاسمونیک اسید 0، 0/01، 0/1، 1، 2 و 4 میلیمولار و هر یک در تیمارهای زمانی 0، 24، 96 و 168ساعت بطور جداگانه و در 3 تکرار کشت شدند. سپس هیوسیامین و هیوسین تولید شده در ریشه ها به وسیله HPLC سنجش و مقایسه شد. همچنین سرعت رشد ریشه ها نیز در این تیمارها مورد بررسی قرار گرفت.
بیشترین مقدار هیوسیامین و هیوسین در ریشه های مویینی که در محیط کشت حاوی 2 میلی مولار جاسمونیک اسید به مدت 24 ساعت کشت شده بودند به ترتیب به میزان 1/8 میلی گرم بر گرم وزن خشک 3) برابر بیشتر از ریشه های شاهد) و 2/2 میلی گرم بر گرم وزن خشک ریشه مشاهده شد. همچنین رشد ریشه ها تحت تاثیر غلظتهای مختلف الیسیتور جاسمونیک اسید با افزایش غلظت کاهش نشان داد.
مقدمه
گیاه بنگدانه H. niger L. گیاهی علفی، یک ساله یا دو ساله، پوشیده از کرک و غده، ساقهها از نیمه منشعب، ضخیم، به ارتفاع 20 تا حداکثر 100 سانتی متر است. زمان گلدهی این گونه، اواخر بهار تا اواسط تابستان میباشد و بیشتر در مناطق خزری ایرانی و تورانی، رویشگاه صخرهها، حاشیه مزارع و جادهها، مناطق مخروبه و عاری از گیاه دیده میشوند (خاتمساز، .(1377 دو تروپان آلکالوئید هیوسیامین و هیوسین، متابولیتهای ثانویه این گیاه بوده که دارای اثر قوی آنتی کولینرژیک بر اعصاب پاراسمپاتیک است و به عنوان رفع اسپاسم، تسکین دهنده درد و برای اتساع زیاد مردمک چشم بهکار برده میشوند (پالازون و همکاران، .(2008
فرسایش ژنتیکی و بهرهبرداری غیر صحیح و بیرویه در گذشتههای نه چندان دور از منابع ژنتیکی، علاوه بر اینکه میزان تولید سنتی را پایین آورده است، باعث به خطر افتادن وجود این منابع گردیده است. بنابراین استفاده از روشهـای بیوتکنولووژیـک به منظور تکثیر و افزایش توان ژنتیکی گیاهان و همچنین شناسایی سریعتر و دقیق تر ژنوتیـپهـایی کـه فـرآورده بیشـتری تولیـد میکنند، میتواند بسیار مفید و از لحاظ تجاری سودآور باشد. امروزه استفاده از ریشه های مویین به عنوان روشی بـرای رسـیدن بـه تولید تجاری محسوب میشوند. در بسیاری از موارد، مقدار این تروپان آلکالوئیدها برای تجاری سازی بسیار پایین می باشـد. یکـی از روش ها برای رفع این محدودیت استفاده از الیسیتورهاست. این ترکیبات، مواد شیمیایی و یا فاکتورهـای زیسـتی از منـابع مختلـف هستند که می توانند موجب تغییرات فیزیولوژیکی ارگانیسم زنده هدف شوند. آنها میتوانند بر روی تولید متابولیت هـای ثانویـه از جمله تروپان آلکالوئیدهای هیوسین و هیوسیامین تاثیر گذارند. این ترکیبات بر روی رسپتورهای غشای گیاه اثر متقابـل گذاشـته و موجب مکانیسم ناشناخته ای می شود. مکانیسم حاصل باعث فعال سازی ژن های خاصی شده و در نتیجه آن بسیاری از متابولیـت های ثانویه سنتز می شود. در میان الیسیتورها، جاسمونات ها و از جمله جاسمونیک اسید به بخشی از مسـیر انتقـال سـیگنالی وارد شده که آنزیم های خاصی را برای کاتالیز کردن واکنش های شیمیایی القا می کنند. در نتیجه این واکـنش، ترکیبـات دفـاعی بـا وزن مولکولی پایین مانند پلی فنلها، آلکالوئیدها، کوینونها و پلی پپپتیدها در گیاه تشکیل میشود (کانگ و همکاران، .(2004
در این تحقیق، ریشه مویین تکثیر و اثر الیسیتور جاسمونیک اسید به عنوان ترکیبات سیگنالی بر میزان تولید هیوسیامین هیوسین و همچنین میزان رشد ریشه های مویین مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
تهیه قطعات جداکشت
بذرهای گیاه بنگدانه بدلیل داشتن پوسته کنگرهای نیاز به از بین بردن آلودگیهای قارچی و باکتریایی دارند. برای حذف این آلودگیها ابتدا بذور به مدت 30 ثانیه در اتانول %96 ضدعفونی و پس از آن در محلول هیپوکلریت سدیم حاوی (v/v)% 1 کلر فعال به همراه دو قطره توئین 80 به مدت 5 دقیقه خیسانیده شدند. سپس 4 مرتبه با آب مقطر استریل به فواصل زمانی 2، 3، 4 و 5 دقیقه شستشو داده شدند. برای تسریع در جوانهزنی نیز بذور با اسید جیبرلیک 200 ppm به مدت 48 ساعت تیمار شدند. بذرهای گیاه جهت جوانهزنی در محیط کشت MS فاقد هورمون کشت شده و در دمای 25 درجه سانتیگراد و در تاریکی نگهداری شدند. برای تولید گیاهچه کامل، بذرهای جوانهزده در محیط کشت جامد B5 به همراه 1 میکرومولار در لیتر هورمون IBA و %3 ساکارز واکشت و در اتاقک رشد در شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای روز 28) درجه سانتیگراد) و دمای شب 15) درجه سانتیگراد) به مدت 4 هفته نگهداری شدند.
القا و انجام تیمار بر ریشه مویین
برای تهیه ریشه های مویین (Hairy root) از سویه اگروباکتریوم رایزوژنز A4 استفاده شد. بدین منظور ابتدا برگ هایی که دارای رگبرگهای واضحتری بودند از دمبرگ جدا و به قطعات کوچک 2 سانتی متری برش داده شدند. سپس با استفاده از سوزن استریل آغشته به باکتری بر سطح زیرین قطعات برگی و بر روی رگبرگها زخم ایجاد شد. سپس قطعات برگی آلوده، بر روی محیط کشت B5 فاقد هورمون و آنتی بیوتیک به مدت 48 ساعت کشت شدند. پس از آن، به محیط کشت جامد B5 حاوی 044 mg/l سفوتاکسیم سدیم واکشت شدند. در نهایت برای رشد سریعتر، ریشه های مویین با طول4 سانتی متر از قطعه برگی جدا و به محیط کشت مایع B5 حاوی 044 mg/l سفوتاکسیم سدیم منتقل شدند.
برای تایید تراریخته بودن ریشه های مویین از روش مولکولی استفاده شد. بدین منظـور ابتـدا DNA از بافـت گیـاهی بـا استفاده از روش کای و همکاران (1997) با کمی تغییرات استخراج و پس از آن واکنش زنجیره ای پلی مراز ( (PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی rolB و rolC و طبق برنامه (دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 3 دقیقه برای واسرشتگی اولیه، 40 چرخـه شامل: دمای واسرشتگی 94 درجه سانتی گراد به مدت 60 ثانیه ، دمای اتصال 54 درجه سانتی گـراد بـه مـدت 1 دقیقـه ، دمـای طویل شدن 72 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه و دمای طویل شدن مرحله نهایی72 درجه سانتی گراد به مدت 6 دقیقه) انجام شد.
جهت انجام تیمار، مقادیر هموزن از ریشه های مویین بطور جداگانه در محیط کشت مایع B5 فاقد هورمون و حاوی غلظتهای جاسمونیک اسید 0/01، 0/1، 1، 2 و 4 میلی مولار و هر یک از غلظت ها در 3 تیمار زمانی(24، 96 و 168 ساعت) و با 3 تکرار کشت شدند. سپس در شیکر انکوباتور با سرعت 110 دور در دقیقه قرار داده شدند. همچنین برای هر یک از غلظتهای الیسیتور در تیمارهای زمانی مختلف شاخص رشد به روش زیر محاسبه شد:
استخراج تروپان آلکاکوئید ها
ابتدا هر یک از ریشه های گیاه در شرایط دمای اتاق و سایه خشک شده، سپس با استفاده از هاون دستی پودر شدند. برای استخراج عصاره تام آلکالوئیدی از روش کامادا (1986) استفاده شد. در این روش به 200 میلی گرم نمونه، 20 میلی لیتر از ترکیب کلروفرم: متانل: هیدروکسید آمونیوم %28 به ترتیب با نسبتهای 1 :5 :15 اضافه، سپس به مدت 1 ساعت در حمام اولتراسونیک با دمای 40 درجه سانتیگراد و فرکانس 42 کیلوهرتز و پس از آن به مدت 1 ساعت در دمای اتاق نگهداری شد. پس از صاف کردن عصاره و خشک کردن آن با دستگاه روتاری، به آن کلروفرم و اسیدسولفوریک 0/5 مولار اضافه و کاملا مخلوط شد. فاز آبی جمع و pH آن با استفاده از هیدروکسید آمونیوم %28 ، بر روی 10-11 تنظیم شد. آلکالوئیدها یکبار با 2 میلی لیتر کلروفرم و دوبار با 1 میلی لیتر کلروفرم استخراج شدند. پس از اضافه نمودن سولفات سدیم، عصاره با کاغذ صافی فیلتر و باقیمانده با 1 تا 2 میلی لیتر کلروفرم شستشو داده شد. در نهایت کلروفرم با دستگاه روتاری تبخیر و آلکالوئید باقیمانده در متانل حل شد.
سنجش آلکالوئیدهای تروپانی
برای جداسازی و اندازهگیری میزان آلکالوئیدهای تروپان از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از شرکت LKB سوئد، ستون C18 Eurospher به طول 25 سانتی متر و قطر 4/6 میلیمتر، نرم افزار chromgate، و آشکارساز PDA مدل K-2800 در طول موج 215 نانومتر استفاده شد. سرعت جریان حلال 1 ml/min و فاز متحرک بصورت ایزوکراتیک حاوی حلال (آمونیوم استات + % 0/1 آب) بود. میزان آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و هیوسین بر اساس سطح زیر منحنی استاندارد محاسبه شد. برای تهیه منحنی استاندارد ابتدا محلولهای استاندارد متانلی از آتروپین و اسکوپولامین با غلظـتهای 500 ، 250، 125 ، 62/5، 31/25 و 15/625 میکروگرم در میلیلیتر تهیه و طیف آنها توسط دستگاه ترسیم گردید. با استفاده از سطح زیر منحنی بدسـت آمده برای غلظتهای فوق الذکر منحنی استـاندارد سطح/غلظت در طول موج 215 نانومتر ترسیم شد.
نتایج
القای ریشه مویین و تایید تراریخته شدن آنها
ریشه های مویین پس از گذشت 35 روز به حداکثر رشد خود رسیدند (شکل .(1 نتایج حاصل از الکتروفورز محصول PCR نمونهها حضور دو ژن rolB و rolC را در ردههای ریشه مویین تایید کرد (شکل .(2 ژنوم استخراج شده از ریشه های مویین شامل دو قطعه به طول 423 bp (مربوط به ژن (rolB و ) 626 bp مربوط به ژن (rolC بودند که در کنترل مثبت DNA) استخراج شده از اگروباکتریوم) و ردههای حاصل مشاهده شد. ژنوم ریشه های شاهد فاقد دو قطعه ژن rolB و rolC بودند.
شکل (1) القا و رشد ریشه مویین از قطعات برگی گیاه Hyoscyamus niger با استفاده از اگروباکتریوم .A4 الف: القای ریشه های مویین از محل زخم. ب: انتقال ریشه ها به محیط کشت جامد .B5 ج: تکثیر ریشه های مویین به محیط کشت مایع B5 پس از گذشت 20 روز. د: تکثیر ریشه های مویین به محیط کشت مایع B5 پس از گذشت 35 روز.
