بخشی از مقاله
مقاله القاي ریشه مویین در گیاه دارویی تشنهداري(Scrophularia striata Boiss)
چکیده
گیاه تشنهداري (Scrophularia striata Boiss.) متعلق به خانواده گل میمونی است که بهطور گستردهايخصوصدرهمه نقاط به
در بخش شمال شرقی ایران پراکنده شده است. این گیاه دارویی داراي متابولیتهاي ثانویه مهمی مانند لینالول، جرماکرین دي، بتا
داماسکون است. لینالول علاوه بر اینکه اثرات ضدمیکروبی و ضدویروسی دارد، بازدارنده رشد تومورهاي سرطانی است. متابولیت
هاي ثانویه در مقادیر کم و در مرحله خاصی از زندگی گیاه تولید میشوند. با توجه به ارزش دارویی آنها، میتوان میزان تولید این
ترکیبات را با استفاده از روشهاي زیست فناوري افزایش داد. االقاي ریشه مویین از سیستمهاي مناسب براي تولید متابولیتهاي ثانویه است. در این تحقیق از باکتري Agrobacterium rhizogenes سویه A13 به منظور القاي ریشه مویین در گیاه تشنهداري استفاده شد. همچنین اثر اسید سینامیک (CA)به عنوان عامل القا کننده بیان ژنهاي vir باکتري با دو غلظت 150ʽM)و (100 براي افزایش کارایی القاي ریشههاي مویین مطالعه شد. تایید مولکولی ریشه هاي مویین با واکنش زنجیرهاي پلی مراز براياز تکثیر بخشی
ژنهاي rolA و rolB انجام گردید.با استفاده از CA با غلظت 100ʽMبیشترین تعداد ریشه القایی( 25 ریشه) بدست آمد. ریزنمونه
هاي مختلف (هیپوکوتیل، کوتیلدون، برگ، دمبرگ) به منظور ارزیابی پتانسیل آنها در القاي ریشه مویین مورد بررسی قرار گرفت.
ریزنمونه هیپوکوتیل با میانگین 4,5 ریشه در هر ربزنمونه بیشترین تعداد ریشه القایی را داشت.این تحقیق اولین گزارش درباره القاي ریشه مویین در گیاه تشنهداري است.
کلمات کلیدي: آگروباکتریوم رایزوژنز، اسید سینامیک، تشنهداري، ریشههاي مویین
مقدمه
گیاه تشنهداري (Scrophularia striata Boiss.) متعلق به خانوادهي گل میمونی((Scrophulariaceae،از گیاهان دارویی مهم است
که داراي خواص دارویی متعددي است. عصاره این گیاه در کاهش بسیاري از فاکتورهاي التهابی نظیر پروستاگلاندین E2، اینترلوکین
1-β، اینترلوکین 2-β، اینترلوکین 4 بسیار موثر است.از متابولیتهاي ثانویه مهم این گیاه میتوان به لینالول، بتاداماسکون و جرماکرین دي اشاره کرد.لینالول یک الکل مونوترپن است و علاوه بر اینکه اثرات ضد افسردگی، ضدمیکروبی، ضد باکتري و ضد ویروسی دارد.از
رشد و توسعه تومورهاي سرطانی نیز جلوگیري میکند. لینالول میتواند شاخص درمان آنتراسیکلینها را در مدیریت سرطان سینه
مخصوصا در تومورهایی که به چندین دارو مقاومت نشان میدهند را بهبود ببخشد(.(5استفاده از ترکیباتی مانند لینالول بهعنوان جایگزینی براي داروهاي ضد سرطان و یا بهعنوان درمان کمکی پیشنهاد شده است.این ترکیبات به مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلولهاي تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولید می شوند .در شرایط آزمایشگاهی ترانسفورماسیون گیاه
با باکتري Agrobacterium rhizogenes منجربه تولید سیستم ریشه مویین با سرعت رشد بالا و توانایی سنتز متابولیتهاي مهم و
١
حتی متابولیتهاي ناشناخته میشود.ثبات بیوشیمیایی و ژنتیکی، توانایی رشد در محیط فاقد هورمون از دیگرویژگیهاي ریشههاي مویین است که استفاده از آنها را در بیوتکنولوژي ترغیب مینماید. براساس منابع علمی قابل دسترس، تا بحال مطالعهاي در مورد
القاي ریشه مویین در گیاه تشنهداري صورت نگرفته است. در این تحقیق براي اولین بار تولید ریشه مویین در این گیاه گزارش می
شود.
مواد و روشها
ضدعفونی بذر و تولید گیاهچههاي درون شیشهاي
بذور گیاه تشنهداري از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شد. بذور پس از ضدعفونی با الکل 70 درصد بهو مدت 1 دقیقه
هیپوکلریت سدیم(با 5 درصد کلر فعال) 1/5 درصد به مدت 5 دقیقه و 3 مرتبه شستشو با آب مقطر استریل در محیط کشت ½MS
کشت گردید.
تلقیح ریزنمونهها براي القاي ریشه مویین
به منظور القاي ریشههاي مویین از سویه A13 باکتري A. rhizogenesاستفاده شد.تلقیح ریزنمونهها با باکتري به روش جعفري و گرفت همکاران (3) صورت .ریزنمونهها شامل کوتیلدون، هیپوکوتیل، برگ وبا سوسپانسون باکتري به روش شناورسازي با مدت زمان
5 دقیقه تلقیح شدند. ریزنمونهها پس از خشک کردن نسبی با کاغذ صافی استریل، جهت همکشتی در محیط کشت <MSحاوي
سینامیک اسید 100 (CA) یا 150ʽM کشت شدند و سپس کشتهادر شرایط تاریکی قرار گرفتند.نمونههايهاي شاهد (ریزنمونه تلقیح نشده) نیز در شرایط مشابه کشت نگهداري شدند.بعد از 72 ساعت هم کشتی ریزنمونهها با باکتري، شستشوي ریزنمونهها در محیط کشت<MSمایع بدون ساکارز حاوي آنتی بیوتیک سفوتاکسیم500 mg/l انجام شد و در نهایتجامدریزنمونهها در محیط حاوي سفوتاکسیم250 mg/l کشت شدند.بعد از ظهور ریشهها هر دو هفته یکبار واکشت انجام شد و طی واکشت مقدار سفوتاکسیم
کاهش داده شدتا بالاخره از محیط حذف گردید.
آنالیز PCR ریشههاي مویین
بهمنظور تائید تراریختی ریشههاي مویین، استخراجDNA از ربشههاي مویین احتمالیبه روش (2) CTAB انجام شدو
واکنش زنجیرهاي پلیمراز (PCR) براي تکثیر بخشی از ژنهايrolA و (1750 bp)rolB انجام شد. برنامهPCR شامل واسرشتهسازي اولیه 5 دقیقه در دماي 94œC و 35 چرخه شامل واسرشتهسازي 1 دقیقه در دماي 94œC ، اتصال آغازگرها 53œCدقیقه،بهمدت 1
بسط 72œC به مدت 1 دقیقه و در نهایت بسط نهایی 72œCبودبه مدت 7 دقیقه . محصولات PCR پس از الکتروفورز روي ژل آگارز
0/8و رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید، بوسیلهعکسبرداريدستگاه GelDoc شدند.
نتایج
القاي ریشه مویین در گیاه تشنه داري
بعد از گذشت 10 روز اولین ریشههاي مویین احتمالیدر نمونههاي تلقیح شده مشاهده شدند، با اینجال در نمونههاي شاهد نیز ریشه
القا شد که عمدتا محدود به انتهاي گیاهچه میشد (شکل -1 الف)، در حالی که در نمونههاي تلقیح شده محل ظهور ریشهها علاوه بر انتهاي گیاهچه،سطح رویی (شکل -1 ب) و پشتی برگ (شکل -1 ج) ، دمبرگ، هیپوکوتیل و کوتیلدون بود (شکل .(1 نتایج نشان داد
که CA مورد استفاده با غلظت 100ʽM نتیجهي بهتري را در القاي ریشه مویین در مقایسه با سینامیک 150ʽM دارد (شکل.(2
