بخشی از مقاله
چکیده
سرخارگل - Echinacea purpurea L. - ، یکی از مهمترین گیاهان دارویی میباشد که مواد موثره آن خاصیت ضد ویروسی و تقویتکنندگی سیستم دفاعی بدن دارند. یکی از راهکارها براي تولید متابولیتهاي ثانویه در شرایط درون شیشهاي، کشت ریشههاي مویین میباشد که داراي پایداري ژنتیکی بوده و رشدي سریع و مداوم دارند.
در این پژوهش، اثر انواع ترکیبات هورمونی روي رشد ریشههاي مویین سرخارگل در شرایط درون شیشهاي بررسی شد. این آزمایش در ارلنهاي 100 ml حاوي 30 ml محیط کشت WPM و 1 g ریشه مویین - قطعات حدود 2 cm حاصل از تلقیح با اگروباکتریوم رایزوژنز سوش - A4 با طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. تجزیه واریانس براي صفات وزن تر، درصد افزایش وزن تر و درصد کالوس نشان داد که از نظر این صفات، بین ترکیبات هورمونی اختلاف بسیار معنیداري در سطح احتمال %1 وجود دارد.
نتایج نشان داد که بیشترین وزن تر - 5/97 g - و درصد افزایش وزن تر - %497 - ریشههاي مویین در تیمار حاوي 0/25 mg l-1 NAA بدست آمده است؛ در حالی که کمترین وزن تر ریشههاي مویین در غلظتهاي مختلف 0/5 mg l-1 - 2,4-D، 0/25 ، - 0/1 بدست آمده است. بر اساس نتایج، در غلظتهاي مختلف IBA نسبت به غلظتهاي مختلف NAA درصد کالوس کمتري تولید شده است.
مقدمه
سرخارگل ، گیاهی علفی و چند ساله میباشد که براي صدها سال به عنوان گیاهی دارویی استفاده شده است این گیاه، یکی از پرفروشترین گیاهان دارویی در بیشتر کشورهاي توسعه یافته است . این گیاه از نظر موارد مصرف در ایالات متحده آمریکا و اروپا، دومین رتبه را بین گیاهان دارویی دارد، به طوري که حدود %10 تجارت مکملهاي دارویی را به خود اختصاص داده است
این گیاه به عنوان یک داروي موثر در پیشگیري و درمان بسیاري از امراض همچون سرماخوردگی، آنفولانزا، عفونتها و التهابات پوستی مورد استفاده قرار میگیرد
تولید اقتصادي گیاه سرخارگل به خاطر عواملی از جمله آلودگی مواد گیاهی با حشرات، قارچها، باکتريها و خاك، تغییر در میزان ترکیبات فعال از گیاهی به گیاه دیگر و از سالی به سال دیگر، فقدان مواد گیاهی خالص و استاندارد براي آنالیزهاي بیوشیمیایی، طولانی بودن دوره رشد و نیز مشکلات برداشت ریشه، با مشکل مواجه میباشد
بنابراین میزان تولید آنها اقتصادي نبوده و ضرورت دارد که براي تولید سریع و انبوه آنها، از فنون کشت بافت گیاهی به طور بهینه استفاده گردد. تولید ریشههاي مویین حاصل از تلقیح ریزنمونه با باکتري گرم منفی خاکزي به نام اگروباکتریوم رایزوژنز، به دلیل سرعت رشد زیاد و نامحدود، کوتاه بودن زمان دو برابر شدن، عدم نیاز به محیط کشت حاوي هورمون و نور، پایداري ژنتیکی بالا و امکان تولید محصولات طبیعی خیلی با ارزش در زمان کم با بازده زیاد، به عنوان یک سیستم جدید و بسیار امیدبخش براي تولید متابولیتهاي ثانویه ریشه اي در شرایط درونشیشهاي مطرح است. با توجه به اینکه ریشههاي مویین هر گونه گیاهی، نیازهاي غذایی مختلفی دارند لذا شرایط کشت بایستی براي هر گونه به طور مجزا بهینه شود .
در تحقیقی از محیط کشتهاي با نمکهاي کامل، یک دوم و یک چهارم و پنج غلظت ساکارز استفاده شده و نتایج نشان دادند که محیط کشت 1/2 B5 همراه با - w/v - %3 ساکارز براي نگهداري ریشههاي مویین بهتر بوده است و اضافه کردن IBA به محیط کشت سرعت رشد ریشههاي مویین را تا 14 برابر افزایش داده است . - Romero et al., 2009 - در تحقیق دیگري، اثر نور مداوم - 60 μmol m−2 s−1 - و تاریکی بر رشد و تولید مشتقات اسید کافئیک در ریشههاي مویین حاصل از ریزنمونه برگی که 28 روز در شرایط درونشیشهاي رشد یافته بودند، بررسی شده و نتایج نشان دادند که نور به طور معنیداري تولید مشتقات اسید کافئیک را افزایش داده است . - Abbasi et al., 2007 - در آزمایش دیگري، با استفاده از ریزنمونه برگ براي ایجاد ریشههاي مویین، ماکزیمم g l-12/21 زيتوده تولید شد . - Liu et al., 2006 - در این تحقیق، به منظور بهینهسازي رشد ریشههاي مویین، اثر چند نوع هورمون و غلظتهاي مختلف آنها روي رشد ریشههاي مویین سرخارگل در شرایط درون شیشهاي بررسی شد.
مواد و روشها
در این تحقیق از اگروباکتریوم رایزوژنز - Agrobacterium rhizogenes - سوش A4 براي تراریختی گیاه سرخارگل و تولید ریشه-هاي مویین استفاده گردید. محیط کشت LB براي کشت اگروباکتریوم رایزوژنز به کار گرفته شد. در این تحقیق اثر 14 ترکیب هورمونی مختلف - جدول - 1 بر رشد ریشههاي مویین بررسی شد. این آزمایش در ارلنهاي 100 ml حاوي 30 ml محیط کشت WPMو 1 g ریشه مویین - قطعات حدود 2 cm حاصل از تلقیح با اگروباکتریوم رایزوژنز سوش - A4با طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. تعداد 3 ارلن براي هر تیمار استفاده شد. 28 روز بعد، صفات وزن تر، درصد افزایش وزن تر و درصد کالوس یادداشت برداري شدند.
نتایج و بحث
نتایج تجزیه واریانس براي صفات وزن تر، درصد افزایش وزن تر و حجم کالوس نشان داد که از نظر این صفات، بین نوع ترکیبات هورمونی و غلظتهاي مختلف آنها، اختلاف بسیار معنیداري در سطح احتمال %1 وجود دارد. مقایسه میانگین اثر ترکیبات هورمونی و غلظتهاي مختلف آنها بر صفات فوق در جدول 1 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که بیشترین وزن تر ریشهها 5/97 g - و - 5/93 و درصد افزایش وزن تر ریشههاي مویین 497 - و - %416 به ترتیب مربوط به تیمارهاي mg l-1 NAA 0/25 و 0/25 mg l-1 IBA + 0/1 mg l-1 NAA میباشد؛ در حالی که کمترین وزن تر ریشه و درصد افزایش وزن تر ریشههاي مویین، در تیمارهاي حاوي هورمون 2,4-D حاصل شد.
نتایج نشان داد که تیمارهاي 0/1، 0/25 و 0/5 mg l-1 2,4-D مانع رشد ریشههاي مویین شدند؛ همچنین بدون انشعاب بودند و خیلی سریع قهوهاي شدند. بنابراین استفاده از هورمون 2,4-D بخصوص در این غلظتها، در کشت ریشههاي مویین سرخارگل توصیه نمیشود.
در تحقیقی بر روي ریشههاي مویین گیاه Polygonum multiflorum نیز بیان شد که 2,4-D اثر ممانعت کنندگی بر رشد ریشهها داشت . - Yu et al., 2006 - همچنین تیمار بدون هورمون - شاهد - ، انشعابات خیلی زیادي نداشت، ولی طول ریشهها خیلی بیشتر از سایر تیمارها بود - حدود 2 برابر - . هیچ گونه کالوسی در این تیمار مشاهده نشد و رتبه یک کیفیت ریشه - رنگ سفید و بدون کالوس - را به خود اختصاص داد.
تیمارهاي 0/1، 0/25 و mg l-0/50 1 IBA حائز رتبه دوم بودند و کالوس خیلی کمی تولید کردند 5 - تا . - %10 تعداد انشعابات خیلی زیاد بود ولی طول ریشهها متوسط بود. تیمار هورمونی 0/1- 0/25 mg l-1 IBA، کالوس خیلی کمی تولید نمود و کیفیت ریشهها خوب بود.
با توجه به وزن تر ریشهها و کیفیت آنها، براي آزمایشهاي بعدي توصیه میشود. تیمارهاي 0/25 mg l-1 IBA + 0/1 mg l- 1 Kin و 0/25 mg l-1 Kin 0/25mg l- 1 IBA + در مقایسه با 0/25 mg l-1 IBA، فقط سبب تولید کالوس بیشتري شدند . - %30 - با افزایش مقدار Kin، کالوس کمی بیشتر شد و تنها قطر ریشههاي مویین بیشتر شد Kin - باعث افزایش کالوس و قطر ریشه شده - . همچنین در تیمار 0/1 mg l-1 NAA + 0/25mg l-1 IBA، انشعابات ریشههاي مویین بیشتر و کالوس نیز تا % 40–45 رسید.
در تیمارهاي 0/1، 0/25 و 0/5 mg l-1 NAA تعداد انشعابات خوب بود ولی عیب آن این بود که بیشترین کالوسزایی را داشته و ضمناً ریشههاي تولید شده نازكتر بودند. با افزایش غلظت هورمون، کالوس بیشتر شد . - %60–65 - تیمار 0/25 mg l-1 NAA + 0/1 mg l-1 IBA، با تیمار قبلی تفاوتی نداشت. در این تیمار نیز تولید کالوس %60 بود. ولی طول ریشهها نسبت به تیمار NAA 0/25 mg l-1 تا حدي بیشتر شد. کشت سلول گیاهی در شرایط درون شیشهاي معمولاً به تنظیمکنندههاي رشد گیاهی نیاز دارند.
اما یکی از ویژگیهاي ریشههاي مویین، رشد سریع آنها در محیط کشت بدون هورمون میباشداکثراً. براي کشت ریشههاي مویین محیط فاقد هورمون استفاده می-شود . - Gupta et al., 2011 - اما تحقیقات متعددي براي بهینه کردن رشد ریشههاي مویین با استفاده از هورمونها صورت گرفته است.
در تحقیقی، اثر پنج هورمون مختلف بر رشد ریشههاي مویین درمنه1 بررسی شد و مشخص شد که 1- 5 mg l-1 از اسید آبسیزیک، سبب تولید بیشترین مقدار زيتوده شده در حالی که 0/5- 1 mg l-1 از -2 ایزوپنتیل آدنین، مانع رشد ریشههاي مویین شده ولی تولید آرتمیزین را افزایش داده است . - Gupta et al ., 2011 - در پژوهش دیگري، اثر ممانعت کنندگی اکسینهاي مختلف روي کشت ریشههاي گیاه Fagopyrum esculentum گزارش شده است
در تحقیقی بر روي رشد ریشههاي بذرالبنج، مشخص شد که غلظت 0/5 mg l-1 IBA در محیط کشت MS بهتر از غلظت 2 mg l-1 IBA بود. غلظت 2 mg l-1 IBA براي پرآوري ریشهها مناسب نبود و سبب تشکیل ریشههاي غیر نرمال و در نتیجه کاهش رشد شد . - Hong et al., 2010 - در پژوهشی دیگر بر روي ریشههاي نابجاي گیاه E. angustifolia، از سه هورمون IAA، IBA و NAA در چهار غلظت مختلف استفاده شد و مشخص شد که غلظت 2 mg l-1 IBA بیشترین زيتوده را تولید کرده است . - Wu et al., 2006 - در تحقیقی، اثر kin و BA در غلظتهاي 0/1 و 1 mg l-1 بر روي رشد ریشههاي مویین جینسینگ بررسی شدند.
