بخشی از مقاله
چکیده
ریشه هاي مویین حاصل از تراریختی با اگروباآتریوم رایزوژنز به دلیل رشد سریع و پایداري ژنتیکی در محیط هاي آشت بدون هورمون می توانند در تولید متابولیت هاي ثانوي مورد استفاده قرار گیرند. خارمریم یکی از مهم ترین گیاهان دارویی مورد استفاده در دنیا می باشد آه در درمان بیماري هاي آبدي - از جمله هپاتیت - C مورد استفاده قرار می گیرد. ترآیب فعال موجود در این گیاه سیلیمارین می باشد.
در تحقیق حاضر تولید ریشه هاي مویین در گیاه خار مریم با استفاده از اگروباآتریوم رایزوژنز به عنوان منبعی براي تولید ترآیب دارویی سیلیمارین مورد مطالعه قرار گرفت. ریشه هاي مویین با استفاده از آلوده سازي ساقه یا قطعات جداآشت برگی با اگروباآتریوم رایزوژنز با دو روش تزریق و غوطه ور سازي تولید شدند. این ریشه ها سپس به منظور تکثیر به محیط مایع انتقال یافته و پس از انجام آنالیزهاي مولکولی با استفاده از تست Gus و همچنین PCR براي دو ژن gus و rol و از نظر وجود ترآیبات فلاونوئیدي با استفاده از HPLC مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج حاصل بیانگر وجود پنج ترآیب: تاآسی فولین, سیلی آریستین, سیلی دیانین، ایزو سیلی بین و سیلی بینین به ترتیب 0/14 ,0/103 ,0/064 ,0/004 و 0/044 میلی گرم در گرم ماده تر بود. عمده ترین فلاولیگنان موجود در این ریشه ها سیلیبین بود آه تاآنون گزارشی در این مورد منتشر نشده است. تولید موفق این فلاولیگنان می تواند سیستم مفیدي براي تولید یا مطالعه بیوسنتز سیلیمارین باشد.
آلمات آلیدي: ریشه هاي مویین, خار مریم, اگروباآتریوم رایزوژنز, سیلیمارین مقدمه
گیاهان منبع عظیمی از ترآیبات دارویی و مواد شیمیایی منحصر بفرد هستند. علیرغم تلاش هاي قابل ملاحظه اي آه صورت گرفته است, تنها چند نمونه محدود از تجاري سازي و بهره برداري از آشت سلولی گیاهان با موفقیت همرا بوده است - مانند تولید شیکونین, بربرین - . مهمترین اشکال آشت هاي سلولی این است آه از نظر ژنتیکی ناپایدار بوده و تولید متابولیت هاي ثانوي در آشت هاي سلولی پائین است.
روش جدید براي افزایش تولید متابولیت هاي ثانوي تراریختی با - عامل ایجاد بیماري ریشه هاي مویین در گیاهان - می باشد. ریشه هاي مویین تراریخته آه در نتیجه آلودگی گیاهان با - باآتري گرم منفی خاآزي - تولید می شوند سیستم جدید و امید بخشی براي تولید متابولیت هاي ثانوي محسوب می شوند. ریشه هاي مویین از نظر پایداري ژنتیکی و بیوسنتزي منحصر بفرد بوده و رشد سریع آنها هم یک مزیت بزرگی محسوب می شود. این ریشه هاي مویین سریع الرشد می توانند به عنوان منبع دایمی براي تولید متابولیت هاي ثانوي ارزشمند مورد استفاده قرار گیرند. بعلاوه, ریشه هاي تراریخته می توانند بصورت گیاهان آاملی باززا شوند و ثبات ژنتیکی خود را در مراحل واآشت و باززایی گیاه حفظ نمایند.
برخی از گونه هاي گیاهی از جمله گیاهان دارویی بطور موفقی با آمک اگروباآتریوم رایزوژنز تراریخته شده اند. خارمریم یکی از مهم ترین گیاهان دارویی مورد استفاده در دنیا می باشد آه در درمان بیماري هاي آبدي در اروپا و آسیا مورد استفاده قرار می گیرد. ترآیب دارویی استخراج شده از این گیاه سیلیمارین است. سیلیمارین یک ترآیب فلاونوئیدي است آه از میوه هاي خشک شده این گیاه استخراج می شود. این ماده مخلوطی از ترآیبات سیلیبین ایزوسیلیبین سیلی دیانین سیلی آریستین و تاآسی فولین می باشد.
سیلیمارین بصورت یک داروي خوراآی براي درمان بیماري هاي آبدي - از جمله هپاتیت - C مورد استفاده قرار می گیرد. دستیابی به روشی آارا و موثر جهت تولید انبوه این ترآیبات می تواند آمک فراوانی به رفع نیاز به این ترآیب دارویی بنماید. در تحقیق حاضر تولید ریشه هاي مویین در گیاه خارمریم با استفاده از اگروباآتریوم رایزوژنز و همچنین تولید ترآیبات فلاونوئیدي در این ریشه ها مورد مطالعه قرار گرفته است.
مواد و روشها
بذرهاي گیاه خار مریم پس از ضد عفونی در محیط MS - موراشیج و اسکوگ - جامد بدون هورمون و در دماي 25 درجه سانتی گراد و نور 16 - ساعت - آشت گردیدند. جهت تراریختی گیاه از باآتري بدون ناقل دوگانه و با ناقل استفاده شد. تولید ریشه هاي مویین از دو طریق صورت گرفت. در روش اول با استفاده از یک سرنگ استریل آشت شبانه باآتري به چند نقطه از ساقه گیاهچه هاي استریل 4 هفته اي تزریق گردید.
در روش دوم ابتدا قطعات جداآشت برگ و ساقه گیاهچه هاي استریل با سوسپانسیون سلولی اگروباآتریوم آلوده شده و پس از سه روز هم آشتی در محیط MS بدون هورمون جهت حذف آلودگی به محیط MS حاوي 250 میلی گرم در لیتر سفوتاآسیم انتقال یافتند. در حالتی آه باآتري واجد پلاسمید pBI121 بود به محیط اخیر 50 میلی گرم در لیتر آانامایسین هم اضافه شد.پس از یک ماه ریشه هاي مویین از نمونه هاي جداآشت قطع و در ظروف ارلن حاوي محیط مایع منتقل گردیده و بر روي شیکر انکوباتور با 150 دور در دقیقه و در تاریکی قرار داده شدند.
ریشه هاي مویین با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی ژن rolB با PCR شناسایی وتائید شدند. آزمون GUS براي ریشه هاي حاوي پلاسمید pBI121 هم انجام گرفت. در نهایت, پس از استخراج فلاولیگنان ها از ریشه ها, مقدار این ترآیبات با استفاده از HPLC مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج و بحث هفت تا ده روز پس از آلوده سازي نمونه ها با اگروباآتریوم رایزوژنز, ریشه هاي مویین در محل زخم قطعات ساقه و برگ ظاهر شدند.
در ساقه گیاهان آامل هم در محل تزریق اگروباآتریوم این ریشه ها ظاهر گردیدند. نتایج این بررسی نشان داد آه تفاوتی بین برگ هاي لپه اي و طبیعی گیاه از نظر درصد تراریختی و تشکیل ریشه هاي مویین وجود ندارد. اما درصد تشکیل ریشه هاي مویین در قطعات جداآشت ساقه آمتر از برگ می باشد. از طرف دیگر درصد تشکیل ریشه هاي مویین در روش تزریق هم آمتر از روش آلوده سازي قطعات جداآشت است. و لذا با توجه به سهولت روش آلوده سازي و آارایی بالاتر آن در مراحل بعدي از این روش استفاده گردید.
یک ماه پس از ظهور ریشه هاي مویین, قطعات 1 تا 2 سانتی متري از این ریشه ها از نمونه هاي قطعات جداآشت بریده و جهت تکثیر در محیط MS مایع آشت گردیدند - شکل . - 3-1 از نمونه هاي یک ماهه آشت مایع استخراج DNA انجام شده و انجام PCR با ژن rolB و تشکیل باند 780 جفت بازي تراریخته بودن این ریشه ها را تائید نمود ریشه هایی آه در نتیجه استفاده از باآتري حاوي ناقل دوگانه pBI121 تولید شده بودند علاوه بر PCR با تست GUS هم ارزیابی شدند. وجود رنگ آبی نشانگر موفقیت تراریختی این ریشه ها می باشد.
بررسی تولید ترآیبات فلاولیگنانی در ریشه هاي مویین هم بیانگر وجود پنج ترآیب زیر بود: تاآسی فولین, سیلی آریستین, سیلی دیانین، ایزو سیلی بین و سیلی بینین به ترتیب 0/044 ,0/103 0/064 ,0/004 و 0/14 میلی گرم در گرم ماده تر بود عمده ترین فلاولیگنان موجود در این ریشه ها سیلیبین بود آه تاآنون گزارشی در این مورد منتشر نشده است. تولید موفق این فلاولیگنان می تواند سیستم مفیدي براي تولید یا مطالعه بیوسنتز سیلیمارین باشد.
