بخشی از مقاله
چکیده
قارچ Aspergillus parasiticus از جمله قارچهای کپکی موجود در محیط هستند که با رشد و تولید سم افلاتوکسین باعث بروز آلودگیهای موادغذایی و در نتیجه بروز عوارض جبرانناپذیری بر روی سلامت انسان از جمله سرطان میشوند. در این پژوهش بعد از خالصسازی قارچهای A. Parasiticus این قارچ بر روی بستره برنج کشت داده شد و با استفاده از حلالهایی چون استونیتریل و متانول در ستونی حاوی آلومنیاکربن، رزین کاتیونی و پشم شیشه افلاتوکسین موجود در این قارچ ها استخراج گردید.
سموم تولیدی با استفاده از روشهای محیط کشت نارگیل-آگار، TLC و HPLC مورد ارزیابی کیفی و کمی قرار گرفت. مشخص گردید که این قارچ توانایی تولید افلاتوکسین را دارد که روی محیط نارگیل-آگار و در زیر نور UV با بازتابش نور فلوروسانس این خاصیت اثبات شد و با استفاده از دو روش TLC و HPLC مشخص گردید قارچ A. Parasiticus توانایی تولید 4 نوع افلاتوکسین را دارد و بهطور میانگین 2/33 میکروگرم در میلیلیتر سم تولید میکند. بنابراین با شناسایی توانایی بالای تولید افلاتوکسین در این قارچها و پیامدهای ناشی از آنها میتوان از گسترش و شیوع این کپکها بر روی موادغذایی و حتی انسان و در نتیجه بیماریهای آسپرژیلوسی ناشی از آنها تا حد زیادی جلوگیری بعمل آورد.
مقدمه
آسپرژیلوسها از دسته قارچهای ساپروفیتیاند که به فراوانی در محیط اطراف ما حضور داشته و بیماران مستعد از طریق هوا، آب، غذا و گردوغبار در معرض تماس با کونیدیهای این قارچ قرار میگیرند .[1] آسپرژیلوس پارازیتیکوس شایعترین نوع این قارچها است که در انواع محیطها وجود دارند .[2] مطالعات انجامشده نشان میدهد که آسپرژیلوس پارازیتیکوس غیر سمزا بسیار نادر است، بنابراین اکثر موارد بیماریزای این قارچ مربوط به تولید سم است .[3]
این قارچها مسبب بیش از 90 درصد عفونتهای قارچی حاد هستند. گونههای قارچ آسپرژیلوس به علت انتشار وسیع در محیط میتوانند موجب بروز عفونتهای بیمارستانی گردند، بهطوریکه مهمترین عامل ایجادکننده عفونت بیمارستانی با منشأ اگزوژن هستند .[4] سم قارچی که توسط این گونه از موجودات تولید میشود افلاتوکسینها هستند در این میان آفلاتوکسین B1 قویترین عامل جهشزایی و سرطانزایی در بین سموم قارچی است.
آفلاتوکسیکوزیس حاد در انسان به دنبال مصرف مواد غذایی آلوده بهصورت هپاتیت شدید همراه با علائمی چون یرقان، افسردگی، اسهال و تخریب بافت چربی تظاهر مییابد .[5] این توکسینها در غذاهای متعدد انسانی و حیوانی یافت میشوند. آفلاتوکسیکوز در کشورهای صنعتی و پیشرفته رخ میدهد و ضمن وابسته بودن به شرایط محیطی، اجتماعی و اقتصادی، به شرایط اقلیمی چون رطوبت و حرارت که برای رشد قارچ مناسب میباشند، نیز بستگی دارد .[6]
روشهای مختلفی جهت تعیین مقدار آفلاتوکسین یا شناسایی قارچهای تولیدکننده آن مورد استفاده قرار میگیرند که شامل روشهای کروماتوگرافی لایه نازک ،کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا ،الایزا ، روشهای مولکولی و استفاده از محیط کشتهای اختصاصی میباشند. بسیاری از اینروشها گرچه حساس، قابل اطمینان و کمی هستند ولی نیازمند استخراج با حلال، مهارت بالا و هزینهبر میباشند.
از اینرو میتوان محیط کشتهای اختصاصی را بهعنوان روشی ساده جهت شناسایی قارچهای تولیدکننده آفلاتوکسین بکار برد .[7] با توجه به اثرات کشنده افلاتوکسین بر سلامت انسان و پیشرفت زیاد بیماری سرطانی در کشور، در این تحقیق بررسی روشهای حساس، اختصاصی و در عین حال سریع برای شناسایی و اندازهگیری افلاتوکسین قارچهای آسپرژیلوس پارازیتیکوس موجود در محیط و مواد غذایی معرفی میشود.
مواد و روشها تهیه و خالص سازی ایزوله قارچی
ایزوله قارچ Aspergillus parasiticus Speare S286 باقابلیت توکسین¬زایی از مرکز پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه گردید و از ایزولههای قارچی با استفاده از آب¬ مقطر استریل سوسپانسیون تهیه شد و این سوسپانسیون در زیر هود و در شرایطکاملاً استریل روی محیط کشت آب - اگار مخطط گردید. تک اسپورهای جوانهزده بعد از 12 تا 18 ساعت به تشتک پتری و لولههای آزمایش حاوی محیط کشت شیبدار PDA انتقال داده¬شدند. کشتهای درون لوله و پتری بعد از 4 تا 5 روز رشد در محیط انکباتور به یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد انتقال داده شدند.
تعیین اولیه توکسینزا بودن قارچ
برای این منظور از محیط کشت نارگیل-آگار استفاده شد. برای تهیه محیط کشت، روش دیویس و همکاران - 1987 - بهطور جزئی اصلاح شد. بدین صورت که ابتدا مقدار 100 گرم پودر نارگیل در 200 میلیلیتر آب جوش ریخته شد، پس از 5 دقیقه و بهم زدن در چند نوبت و زمانی که عصاره نارگیلکاملاً خارج شد، مایع حاصل از 4 لایه پارچه ململ عبور داده شد و 20 گرم پودر آگار به آن اضافه گردید و به مدت 15 دقیقه در فشار 1/5 اتمسفر و دمای 121 درجه سانتیگراد در اتوکلاو سترون و به تشتکهای پتری 8 سانتیمتری منتقل گردید و در زیر نور UV با طول موج 245 تا 366 نانومتر مورد ارزیابی قرار گرفتند .[8]
تولید توکسین در استرینهای قارچی:
بهمنظور استخراج زهرابههای قارچی ابتدا محتویات ارلنها به مدت 24 ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و سپس روی نمونه¬های آسیاب شده بذور آلوده استونیتریل - متانول اضافه شد و سپس به مدت 3 ساعت روی شیکر قرار داده شدند. مخلوط حاصل با کاغذ صافی واتمن صاف گردید و عصاره در فالکونهای تمیز جمعآوری شدند و عصاره حاصل از ستون تصفیه حاوی رزین کاتیونی و مخلوط آلومینا - کربن عبور داده شدند. سپس عصاره عبور دادهشده از ستون تصفیه برای تبخیر حلال به آون 70 درجهسانتی منتقل میگردد.
پس از خشک شدن عصاره استخراجشده محلول متانول-آب به آن اضافه میگردد و به مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار میگیرد سپس محلول متانول-آب و محلول استونیتریل - متانول نیز به آن افزوده گردید و بهمنظور تبخیر مجدد حلال دوباره در آون با دمای 70 درجه سانتی قرار می¬گیرد و درنهایت به عصاره خشکشده، محلول متانول-آب اضافه شد و عصاره¬های استخراجشده در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در نهایت برای سنجش میزان توکسین از دو روش TLC و HPLC استفاده شد
نتایج
بعد از کشت قارچ بر روی محیط کشت نارگیل - آگار، در زیر نور UV هالهای آبیرنگ اطراف کلونی قارچ مشاهده شد این درحالی بود که در شرایطی که نور معمولی را به محیط کشت حاوی قارچها تابیده شد این هاله آبیرنگ مشاهده نشد که این بازتابندگی نور نمایشگر توانایی تولید افلاتوکسین در قارچها میباشد - شکل . - شکل -1 تعیین وجود افلاتوکسین با ایجاد هاله آبیرنگ در اطراف کلونی قارچها در زیر نور UV بر روی محیط کشت نارگیل-آگار: کلونی قارچ آسپرژیلوس فلاووس در زیر نور UV - a - و نور معمولی - - b ، کلونی قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس در زیر نور UV - c - و نور معمولی - - d.
