بخشی از مقاله
چکیده:
به منظورمعرفی روشی جهت تولید درون شیشه اي گیاهان کامل از بافتهاي بالغ پرتقال رقم تامسون ناول، ریز نمونه هاي مختلف شامل مریستم انتهایی، برشهاي برگی و قطعات میانگره اي در محیط هاي شاخه زایی گوناگون کشت شدند. این محیطها بر اساس محیط پایه MT - موراشیگ و توکر، - 1969 همراه با غلظتهاي مختلف هورمونهاي-6بنزیل آدنین - BA - ،-6فورفوریل آمینو پورین - - Kinetin با سطوح 0، 0/2، 0/5، 1وmgL-1 2 و -1نفتالین استیک اسید - - NAA با سطوح 0،0/1، 0/5وmgL-1 1 جهت تحریک شاخه هاي نابجا تهیه شدند. شاخه هاي حاصله جهت تولید ریشه به محیط هاي ریشه زایی حاوي ایندول--3بوتیریک اسید - - IBA وNAA با غلظتهاي0، 0/5وmgL-1 1 منتقل شدند.
بیشترین تعداد شاخه هاي نابجا از قطعات میانگره و در محیطی با BA 1 mgL-1 وNAA 0/1 mgL-1 تولید شدند - میانگین 3/2 شاخه در هر نمونه - . شاخه هاي حاصل از قطعات میانگره اي، در محیطهاي با 0/5 mgL-1و1 NAA بالاترین درصد ریشه زایی را نشان دادند - %76 شاخه ها ریشه تولیدکردند - ، درحالی که شاخه هاي حاصل از ریزنمونه هاي مریستمی ریشه دهی ضعیفی داشته - - %8 و این ریشه ها تنها پس از 2 بار واکشت ظاهر شدند. نتایج حاصله بیانگر قابلیت بسیار بالاتر BA در تحریک شاخه هاي نابجا در مقایسه با کینتین می باشد، همچنین قطعات میانگره اي مناسبترین ریزنمونه جهت باززایی شاخه هاي نابجا از بافتهاي بالغ تعیین گردیدند.
مقدمه
تولید مرکبات در ایران از اهمیت و سابقه طولانی برخوردار بوده و هم اکنون با تولید سالانه3037000 تن - فائو ، - 2006، رتبه هشتم تولید جهانی را به خود اختصاص داده است - . - 4 رقم تامسون ناول که چند دهه قبل به کشور وارد شده بود، هم اکنون بیشترین اهمیت را در استان مازندران - اولین استان از لحاظ تولید انواع مرکبات - داراست. امروزه سیستم هاي تکثیر درون شیشه اي و کشت بافت به صورتی گسترده جهت ریزازدیادي و تولید ارقام جدید گیاهان مختلف بکار می روند.
تا به حال تحقیقات محدودي روي تکثیر درون شیشه اي و باززایی گیاه کامل از زیرنمونه هاي بالغ درختان انجام شده و بیشتر تحقیقات روي بافتهاي جوان متمرکز بوده است که مهمترین دلایل آن آلودگی پایین تر و توان تمایز بالاتر این بافتها می باشد
با اینحال لازم است گاهی جهت اجتناب از مشکلاتی نظیر وجود دوره جوانی طولانی و یا به هم خوردن ژنوتیپ رقم - دراثر تکثیر گیاهچه از طریق بذر - ، کشت با بافتهاي بالغ انجام شود - . - 3 کشت بافتهاي بالغ مرکبات نیز به دلایل فوق کمترگزارش شده است.
سرورا و همکاران - 1998 - تشکیل شاخه نابجا از بافتهاي غیر مریستمی بالغ قطعات میان گره اي را در مرکبات گزارش کردند
کوبایاشی و همکاران - 2003 - توانستند از برشهاي قطعات میانگره اي رقم پرا1 شاخه هاي نابجا تولید کنند -
آلمیدا و همکاران - - 2003 گیاهچه هاي کامل چند رقم پرتقال را از ریزنمونه هاي میانگره اي و قطعات برگ باززایی کردند
در تحقیق حاضر قابلیت باززایی ریزنمونه هاي بالغ مختلف از درختان تامسون ناول شامل مریستم انتهایی، قطعات میان گره اي و قطعات برگی و نیز نیازهاي هورمونی آنها مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها:
شاخه هاي جوان درختان بالغ جدا شده و به آزمایشگاه منتقل شدندو پس از شستشو با آب معمولی، ریز نمونه هاي قطعات برگی ، قطعات میان گره اي و مریستم هاي انتهایی جداسازي و به مدت 30 ثانیه در اتانول %70 و سپس 8 دقیقه در محلول کلرین %0/5 - وایتکس تجاري - %10 به همراه %0/1 Tween20 ضدعفونی شدند. پس از 3 بار شستشو با آب مقطر استریل، نمونه ها در محیط تولید شاخه کشت شدند.
محیط تولید شاخه شامل نمکها و ویتامینهاي - MT موراشیگ و توکر ، 1969 - 8 - - ، 30 grl-1 ساکارز و 8 grL-1 آگار بوده و غلظتهاي مختلف هورمونهاي BA وکینتین - سطوح 0،0/2، 0/5، 1 و - mgL-1 2 و 0 - NAA،0/1، 0/5و - 1 استفاده شدند. pH این محیط ها در حد 5/7 تنظیم و در دماي121 C° و فشار1/1 بار به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شدند. محیط تولید ریشه مشابه محیط هاي تولید شاخه ولی با ترکیبات هورمونی متفاوت، IBA وNAA با غلظتهاي0،0/5وmgL-11 و با %2زغال فعال یا بدون آن - 2 تیمار - تهیه شدند. هر تیمارشامل3 تکرار - پتري - و 3 مشاهده در هر تکرار - سه ریزنمونه مختلف در هرپتري - بود. تجزیه آماري با نرم افزار MSTATC انجام شد.
نتایج و بحث:
باززایی شاخه هاي نابجا در هفته سوم پس از کشت ابتدا درریزنمونه هاي قطعات میانگره اي آغاز شد.در ریزنمونه هاي مریستم انتهایی و قطعات میانگره باززایی با تشکیل کالوس همراه بود
در حالیکه در ریزنمونه هاي قطعات برگی ، در هیچ کدام از محیطها باززایی شاخه و یا تولید کالوس مشاهده نشد. این نمونه ها به تدریج نکروزه شدند.
آلمیدا و همکاران - - 2003و حسنین و ازوز - 2003 - نیز باززایی پایینی را براي قطعات برگی درختان بالغ مرکبات گزارش کرده بودند
بیشترین تعداد شاخه هاي نابجا از قطعات میانگره و در محیطی با BA 1 mgL-1 و0/1 mgL-1 NAA تولید شدند - میانگین 3/2 شاخه در هر نمونه - . این شاخه ها ضخیم و سبز تیره بودند - شکل. - 1 شاخه هاي حاصل از ریزنمونه هاي مریستم انتهایی بیشترین فراوانی را در محیط هاي با 1 mgL-1یاBA 2 دارا بودند - میانگین 1/6 شاخه در هر نمونه - که این شاخه ها نازك تر و سبز کمرنگ - اتیوله - بودند
یانگ و همکاران - 2006 - وجود مقادیر بالاي اکسین در ریزنمونه هاي مریستم انتهایی کومکوات را دلیل نیاز بالاتر این ریزنمونه ها به BA جهت شاخه دهی دانستند
حدود %84 شاخه ها در محیطهاي حاوي BA ایجاد شدند که این نتیجه بیانگر قابلیت بالاتر BA نسبت به کینتین در تحریک شاخه هاي نابجا می باشد.
هیرگودار و همکاران - 2005 - نیز برتري BA نسبت به سایر سیتوکینین ها در ایجاد شاخه هاي نابجا را گزارش کرده بودند - . - 6 بالاترین درصد ریشه دهی شاخه هاي حاصل از قطعات میانگره،در محیطهاي ریشه دهی با 0/5 mgL-1وNAA 1 انجام شد
علیرغم گزارشات متعدد مبنی برَتاثیر مثبت زغال فعال در ریشه زایی ژنوتیپهاي مرکبات
در این تحقیق استفاده و یا عدم استفاده از زغال فعال تفاوتی در تعداد ریشه هاي تولیدي ایجاد نکرد. در این پژوهش روشی براي باززایی گیاهچه کامل از بافتهاي بالغ رقم تامسون ناول معرفی شد که می تواند به منظور تکثیر این ویترو و یا در عملیات انتقال ژن مورد استفاده قرار گیرد.
شکل-1 شاخه هاي نابجاي ضخیم حاصله از قطعات میانگره اي4 هفته پس از کشت
شکل-2 شاخه هاي نابجا در حال باززایی از مریستم انتهایی
