بخشی از مقاله
چکیده
گیاه گوجه فرنگی مورد حمله عوامل بیماريزاي متعددي قرار میگیرد که برخی از آنها باعث وارد آمدن خسارت سنگین اقتصادي میگردند. جدایه Fusarium oxysporum f. sp. lycopersic بر روي ارقام مختلف گوجه فرنگی سبب پژمردگی آوندي می گردد. پژمردگی ناشی از فوزاریوم در مناطق گرمسیر و خاك هاي سبک بیشتر متداول میباشد. روش هاي مختلفی جهت تشخیص این قارچ وجود دارند.
LAMP روش جدیدي جهت تشخیص پاتوژن ها می باشد که در آن تمام واکنش ها می تواند تحت شرایط هم دما انجام شود و نیازي به تجهیزات گران قیمت ندارد. در این پژوهش، جهت تشخیص راحتتر و سریعتر این جدایه، بعد از کشت قارچ در محیط کشت PDA، استخراج DNA ژنومی قارچ انجام شد.
طراحی آغازگرها براي ژن RNA ریبوزومی 28s صورت گرفت و به دنبال آن براي اولین بار، واکنش LAMP انجام شد. واکنش مثبت با دیدن کدورت حاصله و بردن محصول بروي ژل آگارز مشاهده گردید. از مزایاي این روش جدید در مقایسه با سایر روش هاي قبلی می توان به سهولت، سرعت، سلامتی و هزینه پایین آن اشاره نمود.
مقدمه
پژمردگی فوزاریومی در مناطق گرمسیر و خاك هاي سبک بیشتر متداول میباشد. مطالعات مورفولوژیکی نشان داده است که این گونهها تفاوت خاصی با یکدیگر ندارند و تمام گونههاي فوزاریوم مولد پژمردگی آوندي را در گونه F.oxysporum جاي میدهند . - 1 - این قارچ برحسب قدرت بیماريزایی طبقه بندي شده است 4 - ،6،10، - 14 و جدایه Fusarium oxysporum f. sp. lycopersic - FOL - برحسب قدرت بیماريزایی بر روي ارقام مختلف گوجه فرنگی در سطح نژاد طبقه بندي شده است.
تا به حال سه نژاد به نام هاي - race 1, 2, 3 - براي این جدایه گزارش شده است . - 14 - نژاد 1 در سال 1886، نژاد 2 در سال 1945 از اوهایو و نژاد 3 نیز در سال 1978 از استرالیا براي اولین بار گزارش گردیدند
FOL بیشترین خسارت را در دماي خاك حدود 27◦C نشان میدهد. در تحقیقی که توسط روو1 و منزیس2 انجام گرفت، نشان داده شد که FOL تنها در گونههاي Lycopersicon خسارتزا است
تکثیر هم دماي وابسته به حلقه 3 - LAMP - تکنیک تشخیصی جدیدي است که به عنوان گزینه اي ارزان و بدون کاهش حساسیت و سرعت تکثیر DNA توسط نوتومی و همکاران4 در سال 2000 پیشنهاد شد . - 7 - این روش یک DNA پلیمراز و مجموعه اي از 4 پرایمر اختصاصی، که 6 توالی مشخص از DNA هدف را شناسایی می کنند، به کار می گیرد.
روشLAMP سه ویژگی مهم دارد:
- اولاً تمام واکنش ها می تواند تحت شرایط هم دما انجام شود و در مقایسه با PCR معمولی و real-time PCR تجهیزات گران قیمت نیاز نیست.
- ثانیا کارایی و حساسیت تکثیر به میزان زیادي بالا است.
- ثالثاً این واکنش به میزان زیادي اختصاصی است.
در خلال 10 سال گذشته، روش LAMP به علت سادگی، سرعت، کارایی بالا و اختصاصیت ممتازش، به طور گسترده اي در آنالیز اسید هاي نوکلئیک به کار گرفته شده است در این پژوهش، جهت تشخیص سریعتر و راحتتر این قارچ روش مولکولی LAMP براي اولین بار به کار گرفته شد.
مواد و روشها
در ابتدا جدایه مورد آزمایش در محیط کشت PDA رشد داده شد و پرگنه قارچ جهت استخراج DNA ژنومی آماده شد. به منظور نگهداري درازمدت جدایه، در شرایط استریل حلقههایی به قطر 5 میلی متر توسط چوب پنبه سوراخ کن برداشته و به لولههاي شیشه اي درپوش دار حاوي ماسه استریل منتقل شد. لولههاي شیشه اي به مدت یک هفته در دماي اتاق نگهداري و سپس در دماي 4 درجه سانتیگراد نگهداري شد
براي تهیه محیط کشت سیب زمینی دکستروز آگار - PDA - ابتدا میزان 200 گرم سیبزمینی پوست کنده در داخل بشر ریخته شد و بر روي منبع حرارتی قرار گرفت و پس از پخته شدن، عصارة آن با پارچه ململ گرفته شد. عصاره مذکور به همراه 20 گرم دکستروز و 18 گرم آگار در داخل ارلن ریخته و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد. سپس محلول بر روي منبع حرارتی قرار داده شد تا آگار و دکستروز در داخل آب حل شود و محلول یکنواختی بدست آید. سپس به مدت 20 دقیقه تحت فشار 1 اتمسفر و دماي 121 درجه سانتیگراد اتوکلاو شد
به منظور استخراج DNA ژنومی میزان 0/5ml از مسیلیوم قارچ 5 روزه در محیط کشت PDA، به داخل تیوب 1/5ml انتقال داده شد و با ریختن نیتروژن مایع روي آن با اسپات چول خرد گردید. 500µl بافر لیز کننده - 50mM Tris, 50mM EDTA, 3%SDS, 1% BME, - ./1 mg/ml K proteinase اضافه گردید. محلول در 65 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت انکوبه شد. بعد از این مدت 500µl فنول به محلول اضافه و مخلوط گردید و با دور 300×g به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد.
بعد فاز رویی را برداشته و به تیوب جدید انتقال داده و 400µl کلروفورم ایزوآمیل الکل به نسبت 24 به 1 به آن اضافه و مخلوط گردید. سپس سانتریفیوژ بر اساس شرایط قبلیمجدداً صورت گرفت.فاز رویی دوباره به تیوب جدید منتقل و 400µl آمونیوم استات 7/5 M به همراه 50µl اتانول مطلق اضافه و در -20 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه گردید. سپس سانتریفیوژ با دور 1500×g به مدت 20 دقیقه انجام شد. فاز رویی دور ریخته و رسوب حاصله با الکل 70 درصد شستشو داده شد.
بعد از خشک شدن، رسوب در 50µl آب مقطر دو بار استریل حل گردید. طراحی آغازگر براي ژن RNA ریبوزومی 28s با کد دسترسی HM057281.1 براي جدایه FOL با استفاده از نرم افزار PrimerExplorer V.4 انجام گردید. واکنشLAMP در حجم نهایی DNA 5μl - 25µl، 1μl 10mM dNTP، 2μl آغازگر20pmol FIP، 2μl آغازگر20pmol BIP، 0/5μl آغازگر5pmol F3، 0/5μl آغازگرB3 5pmol، 2μl بتائین 10mM،1 μl آنزیمBst DNA پلیمراز، MgSO4 1μl، 2/5μl بافر 10X Bst و 7/5μl آب استریل - در دماي 60˚C به مدت 60 دقیقه و 80˚C به مدت 2 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر - iCycler, BIO RAD, CA, USA - ادامه یافت - تمام دماها یک سیکلی بودند - .
همچنین این واکنش با استفاده از یک بلوك حرارتی در دماي 60˚C به مدت 60 و بدون دماي 80˚C انجام شد. به محض اتمام واکنش تیوب ها خارج گشت و کدورت حاصل از واکنش مثبت مشاهده گردید. همچنین محصول حاصل به همراه یک مارکر نردبانی - Gene Ruler, TM 100bp DNA Ladder - در ژل آگارز یک درصد الکتروفورز و پس از رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید با دستگاه ژل داك عکسبرداري شد
نتایج و بحث
جدایه مورد نظر در محیط کشت PDA کشت شد و بعد از 5 روز از میسیلیوم هاي 5 روزه استخراج ژنوم صورت گرفت
شکل-1 کشت جدایه ها در محیطPDA
آغازگرها با استفاده از برنامه PrimerExplorerV.4 براي ژن RNA ریبوزومی 28s طراحی شد و واکنشLAMP با استفاده از این آغازگرها انجام شد
جدول-1 مشخصات هر کدام از پرایمرها
