بخشی از مقاله
چکیده
رزمارینیک اسید بهعنوان یکی از مهمترین ترکیب فنلی با ارزش دارویی باال در گونههای مختلف گیاهی، دارای خواص زیستیمتعددی از جمله ضد ویروسی، ضد باکتری، ضد تومور و ضد التهاب میباشد. محرکها - الیسیتورها - با تولید پیامهایی باعث تحریک تولید متابولیتهای ثانویه در گیاهان میشوند. نیتریک اکسید - محرک غیرزیستی - یک رادیکال گازی پایدار است که بهعنوان یک مولکول پیامرسان در گیاهان عمل میکند و در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی، نموی و همچنین پاسخ گیاهان به تنشهای محیطی شرکت میکند. با توجه به عدم وجود اطالعات در مورد میزان رزمارینیک اسید و همچنین استفاده از ترکیب SNP به عنوان محرک غیرزیستی در گیاه دارویی پونهسا بیکرک، اثر آن در چهار غلظت - صفر، 25، 50 و 100 میکروموالر - بر میزان تولید رزمارینیک اسید در کشت درون شیشهای نوشاخههای پونهسا بیکرک بررسی گردید. میزان رزمارینیک اسید نمونهها پس از خشک شدن در دمای اتاق به روش HPLC مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از آنالیز نمونهها، افزایش 7/37 درصدی محتوای رزمارینیک اسید را در تیمار 25 میکروموالر نیتریک اکسید در مقایسه با نمونه شاهد - عدم کاربرد نیتریک اکسید - مشخص کرد. همچنین با افزایش غلظت نیتریک اکسید در محیط کشت کاهش شدیدی را در میزان رزمارینیک اسید شاهد بودیم به طوری که میزان این ترکیب از 54/73 میلیگرم بر گرم وزن خشک در نمونه شاهد به 14/61 میلیگرم بر گرم وزن خشک در نمونه تیمار شده با نیتریک اکسید 100 میکروموالر رسید. نتایج این تحقیق عالوه بر مشخص کردن میزان باالی رزمارینیک اسید در گیاه دارویی پونهسای بیکرک، بهبود میزان این ترکیب ارزشمند دارویی را با کاربرد محرک غیرزیستی نیتریک اکسید در غلظت پایین نشان داد.
واژه های کلیدی: رزمارینیک اسید، محرک، نیتریک اکسید، پونهسا بیکرک، HPLC
مقدمه
گیاهان دارویی یکی از مهمترین منابع دارویی میباشند که از هزاران سال پیش کاربرد داشتهاند. سازمان بهداشت جهانی تخمین زده است که بیش از 80 درصد از مردم به صورت سنتی یا مدرن از گیاهان دارویی استفاده میکنند. بهعالوه برخی از داروهای شیمیایی نیز با الگوبرداری از مواد گیاهی ساخته شدهاند . - Tripathi and Tripathi, 2003 - کشور ایران به دلیل دارا بودن شرایط مختلف آب و هوایی، دارای گونههای گیاهی بسیار متنوعی است که تعداد زیادی از آنها اهمیت دارویی دارند. جنس نپتا با نام فارسی پونهسا یا قطرم - از تیرة نعناعیان - ، در نقاط مختلف آسیا، اروپا و شمال آفریقا یافت میشوند. وجود حدود 250 گونه از این جنس از نقاط مختلف جهان گزارش شده است. این جنس در ایران، دارای 68 گونه گیاه علفي یک ساله و چند ساله است که 39 گونه آن انحصاري ایران میباشند . - Mozaffarian, 2006 - با مرور تحقیقاتي که تاکنون بر روي جنس پونهسا - نپتا - بهعملآمده است، مالحظه میشود که این جنس بیشتر حاوي ترکیبات فالونوئیدي - از زیرگروه فالونها - است . - Jamzad et al., 2003 - از ترکیبات دیگر این جنس میتوان به ایریدوئیدها، فنلها و ديترپنها اشاره نمود
. - Takeda et al., 1998; Fraga et al., 1998 - پژوهشهای پراکندهای نیز بر روي اثرات حشرهکشي، ضدالتهابي، ضددردی و ضداضطرابی این گیاهان انجام شده است . - Taskina et al., 2012 - گونه مورد مطالعه با نام علمی Nepet nuda L. گیاهی است علفی، چندساله به ارتفاع 50 تا 90 سانتیمتر که زمان گلدهی آن در رویشگاه طبیعی، در دامنهی کوهها اواخر بهار در منطقه ایرانی تورانی میباشد. پراکندگی این گیاه در ایران، شمال غرب همچون مناطق حفاظت شدهی ارسباران، گرمی و ارومیه است . - Rechinger, 1982 - متابولیتهای ثانویه، مواد آلی شیمیایی پیچیدهای هستند که گیاهان در طول حیات خود تولید میکنند،
ولی در رشد و نمو گیاهان نقشی نداشته و عمدتا به منظور دفع آفات، جذب حشرات گرده افشان و مبارزه با بیماریهای میکروبی در گیاه تولید میشوند - امیدی و فرزین، . - 1388 با توجه به اینکه در طبیعت سرعت تولید متابولیتهای ثانویه آهسته بوده و مدت زمان طوالنی برای تولید الزم است. بنابراین میزان تولید اقتصادی نبوده و ضروری به نظر میرسد که برای تولید انبوه و سریع متابولیت ثانویه و مواد دارویی از فنون کشت بافت گیاهی به طور بهینه استفاده گردد. استفاده از راه کارهای فناوری زیستی از جمله استفاده از محرکها - الیسیتورها - راهحلی مناسب برای تولید سریع و انبوه متابولیتهای ثانویه میباشد - Mulabagal . - and Tsay, 2004 در تحقیقی بر روی گیاه Coleus blumei مشخص شد استفاده از متیل جاسمونات به عنوان محرک غیر زیستی سبب افزایش قابل مالحظهای در میزان رزمارینیک اسید شده است - عیوضی، . - 1390 رزمارینیك اسید فراوانترین دیمرکافئیك اسید و مهم-ترین ترکیب فنلي است که فعالیت پاد-اکسایشي گونه-هاي گیاهی از جمله مریم گلی را به طور عمده به علت وجود این ترکیب ميدانند. شکلهاي تریمر و تترامرکافئیك اسید به علت داشتن خصوصیات منحصر به فرد زیستي از اهمیت دارویي قابل توجهي برخوردار هستند . - Kamatou et al., 2008 - سدیم نیتروپروساید - SNP - یک رادیکال نسبتاً پایدار است.
در ابتدا این گاز بهعنوان آلودهکنندهي محیطی مورد توجه قرار گرفت، هرچند بررسیهاي اخیر نشان داد که نیتریک اکسید - NO - به عنوان ترکیب آزاد شده از سدیم نیتروپروساید میتواند در فرآیندهاي مختلف فیزیولوژیک و نمو مثل جوانهزنی دانه، بسته شدن روزنه، پاسخ به عوامل بیماریزا و نمو ریشه دخالت نمایدDuan et al., 2007 - ؛ . - Neill et al., 2003 در بسیاری از مطالعات نشان داده شده است که سدیم نیتروپروساید در انتقال پیام و پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی نیز دخالت دارد . - Del Rio et al., 2004 - اولین همایش ملی زی ست فناوری گیااهن دارویی و اقرچاهی کوهی اریان 11 شهریور -1396 دانشگاه زنجان نیتریک اکساید بهعنوان پیامبر ثانویه در گیاه عمل می یافتند. غلظتهای مختلف سدیم نیتروپروساید - مولد کند و بیان ژن را نیز القا میکند - Hayat et al., نیتریک اکساید - در محیط پایه MS تهیه گردیدند. .2010 - با عنایت به مزایای ذکرشده سدیم ریزنمونهها پس از رشد کافی از محیط کشت پررآوری نیتروپروساید، در این آزمایش به بررسی اثر غلظت های به محیط کشت MS حاوی غلظتهای مختلف تیمارها مختلف سدیم نیتروپروساید به عنوان محرک غیرزیستی منتقل شدند. از ریزنمونههای دارای رشد یکسان برای بر میزان تولید رزمارینیک اسید در گیاه پونهسای بررسی اثر تیمارها استفاده شد. برای هر تیمار 10 ویال بیکرک تحت شرایط درون شیشهای پرداخته شده است - جهت بدست آوردن مقدار کافی ماده خشک برای تا راهکاری برای افزایش این متابولیت ارزشمند در گیاه اندازهگیری رزمارینیک اسید با دستگاه - HPLC در نظر پونهسای بیکرک ارائه گردد.گرفته شد و در هر ویال 3 ریزنمونه قرار داده شد. مواد و روش ها ریزنمونه های کشت شده در دمای 25±1 درجه سانتی گراد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت کشت و اعمال تیمار: بهمنظور بررسی اثرمحرک غیرزیستی سدیم نیتروپروساید بر میزان تولید تاریکی نگهداری شدند. پس از گذشت دو هفته از اعمال رزمارینیک اسید در گیاهچه های پونهسا بیکرک تیمار، ریزنمونه ها از محیط کشت جدا و جهت حذف محیط کشت از آنها با آب مقطر شستشو شدند. به- nuda L. - - Nepeta در شرایط درون شیشهای آزمایشی در قالب طرح کامل تصادفی در آزمایشگاه منظور تهیه عصاره جهت اندازهگیری میزان رزمارینیک اسید نمونهه اي برگی در دماي اتاق - 28 درجه سانتی گروه علوم باغبانی دانشگاه فردوسی مشهدبه اجرا درآمد. غلظتهاي مختلف سدیم نیتروپروساید - منبع گراد - خشک گردیدند.
تولیدکننده 0 - - NO، 25، 50 و 100 میکروموالر - بود. اندازهگیری رزمارینیک اسید گیاه پونهسا بیکرک از استان اردبیل جمعآوری و بدین منظور جهت آمادهسازی نمونهها، یک گرم برگشناسایي گردید. نمونه هرباریومی آن در دانشکده علوم پودر شده از آنها در 10 میلیلیتر حالل متانول ویژهی دانشگاه فردوسی با کد هرباریومی 6302 نگهداري می- - 80% - HPLC به نسبت 1:10 حل گردید و به مدت شود. بذرهای سالم و یکنواخت پونهسا بیکرک از بوتهها 24 ساعت روی شیکر قرار داده شد. سپس به مدت 10 جدا شدند. بذور قبل از انجام آزمایش، براي ضدعفوني، دقیقه در3500 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. بخش در محلول هیپوکلریت سدیم %5 به مدت 1 دقیقه و باالیی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرسرنگی 0/45 اتانول 96 درصد به مدت30 ثانیه قرارگرفتند. سپس میکرون یکبار مصرف، به داخل میکروتیوب منتقل شد. 4-3 بار با آب مقطر، شستشو شدند. بذرهاي ضدعفونی نمونه ها تا قبل از آنالیز در دمای -4 درجه سانتیگرادشده در محیط کشت موراشیک و اسکوگ 50 - درصد - نگهداری شدند. به منظور تعیین مقدار رزمارینیک اسید pH: 5/7 ، آگار 8 گرم در لیتر، ساکاروز 15 گرم در لیتر موجود در عصاره از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بدون هورمون کشت شدند تا جوانهزده و گیاهچه ها باال استفاده گردید. فاز متحرک شامل متانول %80 با تولید شوند. جهت تکثیر ریزنمونه ها، شاخساره های سرعت جریان 0/4 میلیلیتر در دقیقه، دمای 25 درجه تولیدی از گیاهچههای اولیه مجدداً در محیط مذکور سانتیگراد و حجم تزریق 100 میکرولیتر بود. برای به صورت ریز قلمه کشت شدند. با رشد قطعات جدید، آنالیز نمونه های اسید رزمارینیک از طول موج 280 عمل تکثیر قطعات جدا کشتها، هر چهار هفته انجام نانومتر استفاده شد. با مقایسه زمان بازداری و سطح زیرشد و بدینصورت تعداد کافی ریزنمونه نوپدید تکثیرمنحنی نمونه با نمونه استانداردهای اسید رزمارینیک
