بخشی از مقاله
چکیده
اشریشیاکلی یک باکتری رایج موجود در دستگاه گوارش و روده باریک طیور است و ممکن است حالت پاتوزن داشته باشد.
اشریشیاکلی باکتری بیماری زای فرصت طلب بوده که بصورت ثانویه سبب بروز بیماری میگردد. عفونت های بوجود آمده توسط اشریشیاکلی باعث خسارات اقتصادی در صنعت طیور می شوند. هدف از این تحقیق شناسایی ژن های کد کننده کپسول و فیمبریه در جدایه های مدفوع طیور گوشتی سالم در کرمان است. در مجموع 100 جدایه اشریشیاکلی از طیور جمع آوری گردید و جدایه ها بر اساس تست های بیوشیمیایی و باکتریولوژی استاندارد تشخیص داده شدند.
به منظور شناسایی ژن های kpsMT III, ,ibeA, PAP EF fimH , PAI واکنش Multiplex-PCR در شرایط آزمایشگاهی انجام شد. نتایج نشان دادکه از 100نمونه جمع آوری شده تعداد 80 جدایه - 80 درصد - واجد ژن fimH، 20 جدایه - 20 درصد - دارای ژن kpsMT III، 8 جدایه - 8 درصد - دارای ژن 3 ,PAP A جدایه - 3درصد - دارای ibeA و 16 جدایه - 16 درصد - دارای ژن PAPEF بودند. بیشترین و کمترین فراوانی ژن به ترتیب در تحقیق حاضر fimHو ibe A بود. روش PCR راهی در جهت تشخیص سریع فاکتورهای حدت در اشریشیاکلی جدا شده از نمونه های دامی بوده که میتوان جهت بررسی های اپیدمیولوژیکی و مبارزه سریع با بیماری استفاده نمود.
مقدمه
اشریشیاکلی مهم ترین باکتری بی هوازی اختیاری ساکن مجاری گوارشی حیوانات خونگرم و انسان است - . - 1 باکتری اشریشیاکلی جزء فلور طبیعی دستگاه گوارش انسان، پستانداران و پرندگان است که عموما بعنوان یک بیماری زای فرصت طلب محسوب می شود و حدود15-10 درصد از جمعیت این باکتری را سویه های بیماری زای پرندگان Coli - APEC - Avian Pathogenic Escherichia تشکیل می دهند
اغلب به دنبال آسیب دیدگی سیستم ایمنی و یا در هم شکسته شدن سد دفاعی پرندگان اهلی، سویه های APEC سبب عفونت های سیستمیک و یا موضعی می گردند - . - 3در پرندگان عفونت های اشریشیاکلی موجب تظاهرات بالینی مختلفی می گردند که معمول ترین شکل آن کلی سپتی سمی می باشد که همه ساله خسارات اقتصادی فروانی راب صنعت طیور وارد می کند
اشریشیا کلی جزء فلور طبیعی دستگاه گوارش پرندگان محسوب می شود. عوامل حدت که غالبا به سویه های بیماری زای اشریشیاکلی طیور نسبت داده میشوند شامل فیمبریه، دارابودن تاژکو تولید آئروباکتین، تولید باکتریوسین ها، تولید همولیزین، وجود پلاسمیدهای بزرگ، مقاومت دارویی و بعضی عوامل دیگر می باشند
اتصال اولین مرحله ضروری برای بیماری زایی اشریشیاکلی توسط فیمبریه FimH می باشد
تا کنون در سطح سویه های اشریشیاکلی جدا شده از طیور فیمبریه های مختلفی شناسایی شده است که آنها را می توان در دو گروه اصلی فیمبریه حساس به مانوز یا تیپ یک و فیمبریه مقاوم به به مانوز یا دسته P تقسیم بندی نمود. فیمبریه تیپ I به وسیله دسته ژنی fim کد می شوند که اکثر باکتری های خانواده آنترو باکتریاسه واجد این ژن ها بوده و در سویه های بیماری زا و غیر بیماری زا حضور دارد - 7و. - 8 فیمبریه P که به وسیله دسته ژنی pap کد میگردد. تا کنون این فیمبریه فقط در سطح سویه های بیماریزای اشریشیاکلی جدا شده از طیور و بوقلمون شناسایی شده است که با سویه های عفونتزای دستگاه ادرای در انسان در ارتباط است
پیلی توسط دستجات ژنی pap که متشکل از زیرواحد های papC, papH, papA, papG, papF, papE می باشد، ایجاد میشود
از دیگر عوامل حدت کپسول می باشد - . - 11 کپسول در سویه های پاتوژنیک خارج روده ای به صورت نازک، منقطع، اسیدی و مقاوم به حرارت است. کپسول دارای چندین نقش می باشد، از جمله مقاومت در برابر فگوسیتوز، مقاومت به کشندگی سرم و از فاکتورهای موثر در اتصال تشکیل بیوفیلم است. ژن های متعددی در تشکیل کپسول نقش دارند که ژن های kps هستند.یکی از ژن های کد کننده کپسول در اشریشیاکلی kpsMT III می باشند
مواد و روش کار
جمع آوری نمونه ها وجداسازی باکتری اشریشیاکلی: این مطالعه بر روی 100 نمونه مدفوعی طیوردر کرمان انجام شده است. سوآب مدفوعی اخذ شده از طیور در لوله های استریل حاوی محیط کشت نوترینت براث قرار داده شد. پس از انتقال لوله ها به آزمایشگاه سوآب اخذ شده به صورت خطی خطی روی روی محیط MacConkey Agar - مرک آلمان - کشت داده شدند. پس از 24 ساعت گرم خانه گذاری در دمای 37 درجه سانتی گراد پرگنه های صورتی رنگ لاکتوز مثبت روی محیط مک کانکی آگار، با انجام سایر تست های بیوشیمیایی تفریقی از قبیل: TSI، اوره، اندول، واکنش متیل رد، وژس پروسکوئر، سیمون سیترات و جلای فلزی در EMB تشخیص داده شدند.
بررسی حضور ژن های کد کننده کپسول و فیمبریه: استخراج DNA با استفاده از روش جوشاندن انجام گرفت. پس از استخراج DNA آزمایش Multiplex PCR ژن هایibeA, PAP EF kpsMT III, fimH , PAI با استفاده از پرایمرهای اختصاصی استفاده گردیدکه توسط Yamamoto و همکارانش در سال 2007 ارائه شده بود
نتایج
بر اساس نتیجه آزمایش مولتی پلکس PCR جهت شناسایی ژن های نامبرده، از بین 100 جدایه مورد مطالعه، تعداد 80جدایه - 80 درصد - واجد ژن fimH، 20 جدایه - 20 درصد - دارای ژن kpsMT III، 8 جدایه - 8 درصد - دارای ژن 3 ,PAP A جدایه - 3درصد - دارای ibeA و 16 جدایه - 16 درصد - دارای ژن PAPEF بودند. بیشترین و کمترین فراوانی ژن به ترتیب در تحقیق حاضر fimH و ibe A بود.
بحث
گرچه مطالعه در مورد فیمبریه اشریشیاکلی از سالیان قبل شروع شده است اما جداسازی و تعیین هویت فیمبریه در سویه های جدا شده از طیور از سال 1993 مورد تئجه قرار گرفته است. در سال 1980 نشان داده شد که اکثر سویه های بیماری زا برای طیور واجد فیمبریه می باشند و هماگلوتیناسیون گلبول های قرمز با حضور فیمبریه در سطح اشریشیاکلی در ارتباط است - Yershaimi . - 15 در سال 1990 وجود فیمبریه - پیلی - با تحت واحد اصلی 18 کیلودالتونی را در سویه های اشریشیاکلی جدا شده از طیور تایید نمود
انوری و همکاران در سال 1387 در بررسی اپیدمیولوژیک ژن های حدت سویه های اشریشیاکلی جدا شده از طیور مبتلا به عفونت ادراری نشان دادند درصد شیوع ژن های hly, sfa, pap, cnf-1 در میان سویه ها به ترتیب 27/1 درصد، 14/6 درصد، 13/5 و 22/9 درصد بود. تعداد 32 نمونه - 33/3 درصد - برای حداقل یکی از ژن ها وشش نمونه برای تمامی چهار ژن مثبت بودند. شایع ترین ژن ها pap/sfa بودند - . - 17 به دلیل اختلاف تعداد و درصد میزان گزارش شده از ژن های مختلف احتمالا به نوع نمونه مورد مطالعه، نوع سویه، نوع پرنده، نحوه پرورش، نوع عادت غذایی، سطح عمومی بهداشت منطقه و حتی روش نمونه گیری مربوط باشد
